課題進展匯報

課題進展匯報STR非變性HPLC快速診斷唐氏綜合征方法的建立及評價RapidprenataldiagnosisofDownSyndromebynon-denaturinghigh-performanceliquidchromatographywithshorttandemrepeatmarkers1概述唐氏綜合征(Downsyndrome，DS)，又稱21三體綜合征或先天愚型，是人類最常見的染色體數(shù)目異常導(dǎo)致的遺傳性疾病，是先天智力低下的最常見原因。新生兒發(fā)病率約1/800-1/600。DS的遺傳分型：（1）21三體型(游離型)：47,XX(XY),+21，占92.5%（2）易位型：46,XX(XY),-14,+t(14q21q)，占4.8%（3）嵌合型：46,XX(XY)/47,XX(XY),+21，占2.7%（4）雙重三體，較罕見（5）21部分三體234新生兒的DS發(fā)生率約為1‰～2‰，我國目前大約有60萬以上的DS患兒。該病目前缺乏有效的治療手段，預(yù)防DS患兒出生是防治該病的主要措施。因此，建立一種快速、準確、低成本、高通量、自動化程度高的唐氏綜合征產(chǎn)前診斷方法對于優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。研究背景5國內(nèi)外相關(guān)產(chǎn)前診斷方法現(xiàn)狀：超聲波篩查：通過超聲波檢查胎兒頸部半透明組織厚度、股骨長度與肱骨長度、心臟異常情況、胎兒鼻骨發(fā)育情況、孕早期胎兒靜脈導(dǎo)管血流檢測等以達到診斷目的。該方法陽性率低，假陽性率高，易漏診誤診。孕早、中期母體血清相關(guān)標記物結(jié)合孕婦年齡篩查：主要相關(guān)血清標記物有相關(guān)血漿蛋白(PPA)、甲胎蛋白(αFP)、游離雌三醇(μE3)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)。檢出率為60-70%，假陽性率5%。羊水細胞培養(yǎng)、染色體G顯帶核型分析：經(jīng)典方法，但費時長(2-3周)，手工操作量大，羊水細胞培養(yǎng)成功率低。熒光原位雜交(Fluorescencein-situhybridization，F(xiàn)ISH)：該方法準確率高，但同時技術(shù)要求高，成本昂貴。6PCR熒光染料定量分析法：同時擴增21號染色體的人肝型磷酸果糖激酶基因(PEKL2CH21)外顯子8和1號染色體的人肌型磷酸果糖激酶基因(PEKM2CH1)外顯子9，擴增產(chǎn)物經(jīng)熒光染料標記后，再用凝膠成像系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進行吸光度分析。該方法操作較繁瑣，不能實現(xiàn)對大人群的高通量篩查。PCR擴增短串聯(lián)重復(fù)序列(ShortTandemRepeats，STR)后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染，進行DNA密度分析：該方法操作繁瑣，費時長，靈敏度低，不能實現(xiàn)高通量篩查。STR熒光定量PCR分析方法：通過分析峰面積比值或出峰個數(shù)進行診斷。但該方法成本較高，僅合成標記探針就需數(shù)千元，而且在產(chǎn)前診斷方面特異性稍差。7相對以上技術(shù)而言，DHPLC技術(shù)是一種高通量、快速、準確、靈敏度高、經(jīng)濟、自動化程度高的遺傳變異篩查技術(shù),在非變性溫度條件下，可以對不同長度的雙鏈DNA片段進行分離。近期大量研究發(fā)現(xiàn)，多余的片段中含有21q22帶，就會患DS，反之則不會患病。表明21q22是DS的關(guān)鍵區(qū)域。STR均勻地分布于人類基因組中，具有高度多態(tài)性和高雜合度等特點，并遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律。由此引出對本課題的研究。8研究內(nèi)容

STR位點的選取：通過網(wǎng)上資源及實際分析，選取理論及實際雜合度較高的STR位點。方法的建立與優(yōu)化：對所選實際雜合度較高的STR位點進行PCR擴增，利用非變性高效液相色譜技術(shù)分離PCR產(chǎn)物中不同片段長度的DNA片段，由不同的峰型可以診斷DS患者并鑒定其染色體的親代來源。方法的評價：用細胞培養(yǎng)、染色體G顯帶核型分析方法同時對所有樣本進行確診，與本課題所建立方法進行雙盲評價。9技術(shù)路線10(1)標本的收集：收集20例DS家系和100例正常人群外周血標本，家系標本每份分為兩組，一組進行細胞培養(yǎng)及G顯帶核型分析，另一組提取DNA。(2)STR位點的選?。豪镁W(wǎng)上資源選取理論雜合度較高(>0.8)的STR位點，然后通過對100例正常人群標本的分析，獲得實際雜合度較高的STR位點。(3)PCR條件的建立及優(yōu)化：PCR擴增所選實際雜合度較高的STR位點。(4)非變性高效液相色譜技術(shù)診斷DS方法的建立：分離不同長度的PCR擴增產(chǎn)物，優(yōu)化條件使本方法可以用于DS產(chǎn)前診斷并鑒定患者染色體的親代來源。(5)評價實驗：用細胞培養(yǎng)、染色體G顯帶核型分析方法與本課題所建立方法進行雙盲評價。研究方案11（1）首次將DHPLC技術(shù)應(yīng)用于唐氏綜合征產(chǎn)前診斷的研究，目前，國內(nèi)外均未見報導(dǎo)。（2）本課題所選取的STR位點均位于21q22帶這一關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)，且具有高雜合度特點，通過對數(shù)個STR位點的同時檢測，幾乎可以對所有類型的DS做出診斷（嵌合型DS患者體內(nèi)三體型細胞比例低者除外），可以對99.9%以上的DS患者做出診斷。（3）本方法同時具有快速、準確、低成本、高通量等其它方法不具備的優(yōu)點。特色與創(chuàng)新點12已完成了21例DS家系標本的采集工作(細胞染色體核型分析確診工作已完成)，并已提取DNA，正常人群標本100例也已采集并提