實(shí)驗(yàn)三簡單染色法

實(shí)驗(yàn)三簡單染色法第一頁，共二十九頁，2022年，8月28日目的要求學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)，掌握細(xì)菌的簡單染色法。初步認(rèn)識細(xì)菌的形態(tài)特征。學(xué)習(xí)顯微鏡（油鏡）的使用方法，熟悉無菌操作技術(shù)。第二頁，共二十九頁，2022年，8月28日簡單染色：利用單一染料對菌體進(jìn)行染色。染料是一類苯環(huán)上帶有發(fā)色基團(tuán)和助色基團(tuán)的有機(jī)化合物。前者賦予染料顏色特征，后者使染料能形成鹽。常用的微生物細(xì)胞染料都是鹽，分酸性染料和堿性染料兩大類：美藍(lán)（即亞甲藍(lán)）、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、番紅（即沙黃）、孔雀綠等都屬于堿性染料；酸性復(fù)紅、伊紅及剛果紅屬于酸性染料。第三頁，共二十九頁，2022年，8月28日在中性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷；堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷，易與細(xì)胞結(jié)合使其著色。細(xì)胞處于酸性條件下（如細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸），所帶正電荷增加，可采用酸性染料染色。微生物染色原理第四頁，共二十九頁，2022年，8月28日材料菌種金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌染色劑儀器或其他用具：顯微鏡酒精燈載玻片接種環(huán)香柏油二甲苯擦鏡紙生理鹽水等。第五頁，共二十九頁，2022年，8月28日涂片干燥固定染色水洗鏡檢簡單染色方法干燥第六頁，共二十九頁，2022年，8月28日作業(yè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告（結(jié)果部分：繪圖說明金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的形態(tài)特征，注明觀察時(shí)使用的物鏡及放大倍數(shù)）下一個實(shí)驗(yàn)：革蘭氏染色法第七頁，共二十九頁，2022年，8月28日1、涂片取一塊干凈的載玻片，平放，在載玻片中央滴一小滴生理鹽水；用接種環(huán)無菌操作從瓊脂斜面上挑取適量菌苔；將挑取的菌苔沾入載玻片中央生理鹽水中混勻并涂成薄膜。注意：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多；涂片要涂抹均勻，不宜過厚。第八頁，共二十九頁，2022年，8月28日第九頁，共二十九頁，2022年，8月28日2、干燥將涂好菌膜的載玻片平放在室溫下自然干燥。也可用電吹風(fēng)低溫吹干。第十頁，共二十九頁，2022年，8月28日3、固定手持(木夾夾住)已干燥的涂有菌膜的載玻片，涂面朝上，在酒精燈火焰上通過2~3次。原理：加熱使細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)凝固，從而固定細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上。注意：熱固定溫度不宜過高，否則會改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。第十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日4、染色將熱固定的細(xì)菌涂片平放于在載玻片架上，滴加染液于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜）。染色時(shí)間：呂氏堿性美藍(lán)染色1~2min；石炭酸復(fù)紅染色約1min草酸銨結(jié)晶紫染色約1min。第十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日5、水洗將細(xì)菌涂片上染液倒入廢液缸中；手持細(xì)菌染色涂片，置于廢液缸上方，用洗瓶中自來水沖洗涂片，直至流下的水無色為止。注意：水洗時(shí)，不要直接沖洗涂面，而應(yīng)使水從載玻片的一端流下。水流不宜過急，過大，以免涂片薄膜脫落。第十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日6、干燥自然干燥：平放于室溫，自然干燥；吹干：用電吹風(fēng)冷風(fēng)或低溫?zé)犸L(fēng)吹干；吸干：平放在一張吸水紙上，上面覆蓋一張吸水紙，將細(xì)菌涂片兩面水分吸干。第十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日7、鏡檢涂片干后鏡檢。防止水的折射，以便于觀察。第十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)（P41）1.物鏡轉(zhuǎn)換器2.物鏡3.標(biāo)本夾4.載物臺5.聚光器6.彩虹光圈7.光源8.鏡座9.電源開關(guān)10.光源滑動變阻器11.粗調(diào)螺旋（粗調(diào)節(jié)器）12.微調(diào)螺旋（細(xì)調(diào)節(jié)器）13.鏡臂14.鏡筒15.目鏡16.玻片夾推進(jìn)器第十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日顯微鏡使用操作步驟1、觀察前的準(zhǔn)備2、顯微鏡觀察3、顯微鏡使用完畢后的處理第十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日1、觀察前的準(zhǔn)備仔細(xì)閱讀顯微鏡使用說明書取鏡（一手握鏡臂，一手托底座）顯微鏡的放置（平放，距邊緣約10cm）熟悉顯微鏡，檢查顯微鏡調(diào)節(jié)光源（光線均勻，亮度適宜）調(diào)節(jié)雙筒顯微鏡的目鏡調(diào)節(jié)聚光器數(shù)值孔徑檢查顯微鏡物鏡、目鏡、聚光器第十八頁，共二十九頁，2022年，8月28日2、顯微觀察觀察程序如下：放置觀察標(biāo)本低倍鏡觀察高倍鏡觀察油鏡觀察第十九頁，共二十九頁，2022年，8月28日將標(biāo)本玻片置于載物臺上(注意標(biāo)本朝上)，用標(biāo)本夾夾住，移動推進(jìn)器使觀察對象處于物鏡的正下方。放置觀察標(biāo)本第二十頁，共二十九頁，2022年，8月28日下降低倍物鏡，從側(cè)面注視調(diào)節(jié)，使其接近標(biāo)本。雙眼看目鏡，慢慢旋轉(zhuǎn)粗調(diào)節(jié)螺旋使鏡筒緩慢升起，至視野內(nèi)出現(xiàn)物象后，改用細(xì)調(diào)節(jié)螺旋，上下微微轉(zhuǎn)動，直至視野內(nèi)獲得清晰的物象。慢慢移動玻片夾推動器，尋找要觀察的部位，置于視野中心，觀察、記錄結(jié)果，并準(zhǔn)備換高倍鏡觀察。低倍鏡觀察第二十一頁，共二十九頁，2022年，8月28日將高倍物鏡轉(zhuǎn)至鏡筒下方(在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，要從側(cè)面注視，以防低倍鏡未對好焦距而造成鏡頭與玻片相撞)。調(diào)節(jié)光圈和聚光鏡，使光線亮度適中，再仔細(xì)轉(zhuǎn)動微調(diào)螺旋，調(diào)節(jié)焦距，獲得清晰物象，移動推動器選擇最滿意的鏡檢部位，待油鏡觀察。

高倍鏡觀察物鏡的同焦現(xiàn)象（P44）第二十二頁，共二十九頁，2022年，8月28日用粗調(diào)螺旋將鏡筒上升，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器將油鏡轉(zhuǎn)至鏡筒正下方。在標(biāo)本鏡檢部位滴上一滴香柏油。從側(cè)面注視，慢慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋，小心下降鏡筒，使油鏡浸入油中，并幾乎與標(biāo)本接觸時(shí)為止(注意切勿壓到標(biāo)本，以免壓碎玻片，甚至損壞油鏡頭)。調(diào)節(jié)聚光器及照明后，眼看目鏡，微微轉(zhuǎn)動粗調(diào)螺旋將鏡筒上升，當(dāng)視野中有模糊的標(biāo)本物象時(shí)，改用細(xì)調(diào)螺旋，并移動標(biāo)本直至標(biāo)本物象清晰為止。油鏡觀察第二十三頁，共二十九頁，2022年，8月28日油鏡的工作原理（P42）1、增加照明亮度2、增加顯微鏡的分辨率第二十四頁，共二十九頁，2022年，8月28日1、增加照明亮度使用油鏡時(shí)，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與接物鏡之間，不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱為油浸系。如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，則稱為干燥系。第二十五頁，共二十九頁，2022年，8月28日一些物質(zhì)的折射率：水1.33

玻璃1.52

空氣1.0

香柏油1.515第二十六頁，共二十九頁，2022年，8月28日2、增加顯微鏡的分辨率分辨率（分辨力）是指顯微鏡能辨別物體兩點(diǎn)間最小距離的能力。式中=光波波長數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度(稱鏡口角)的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)折射率所得的乘積，可用下列公式表示：其中第二十七頁，共二十九頁，2022年，8月28日香柏油的折射率大于空氣和水，因此，它作介質(zhì)時(shí)，數(shù)值孔徑值高于低倍鏡和高倍鏡。數(shù)值孔徑值越大，顯微鏡最小可分辨距離越小，即分辨率越高。

第二十八頁，共二十九頁，2022年，8月28日觀察