實(shí)驗(yàn)三聚丙烯酰胺凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)三聚丙烯酰胺凝膠電泳第一頁，共三十三頁，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的分離蛋白質(zhì)是生物大分子化合物，具有膠體性質(zhì)、沉淀、變性和凝固等特點(diǎn)蛋白質(zhì)分離純化的方法主要有：鹽析、透析、超離心、電泳、離子交換層析、分子篩層析等方法。第二頁，共三十三頁，2022年，8月28日電泳技術(shù)電泳蛋白質(zhì)在一定的pH溶液中可帶有電荷，成為帶電顆粒，在電場(chǎng)中向相反的電極方向泳動(dòng)。由于蛋白質(zhì)的分子量和電荷量不同，其在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率也不同，從而將蛋白質(zhì)分離成泳動(dòng)速率快慢不等的條帶。電荷的來源蛋白質(zhì)帶有可解離的氨基（-NH2）和羧基(-COOH),是典型的兩性電解質(zhì)，在一定PH條件下會(huì)解離帶上電荷COO-COO-COOH╱+H+╱+H+╱Pr←————→Pr←————→Pr ╲+OH-╲+OH-╲NH2NH3+NH3+PH>PIPH=PIPH<PI第三頁，共三十三頁，2022年，8月28日遷移率電場(chǎng)力F=EQ（E：電場(chǎng)強(qiáng)度，Q：電荷)阻力F=6πγηυ（γ：半徑，η：介質(zhì)粘度）υ/E表示單位電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，稱為遷移率，也稱位泳動(dòng)度，以μ表示：μ=υ/E=Q/πγη

可見，離子的遷移率在一定條件下取決于粒子本身的性質(zhì)，即其所帶的電荷和形狀。不同的粒子有不同的遷移率，因此電泳一定時(shí)間就可分開它們。第四頁，共三十三頁，2022年，8月28日樣品性質(zhì)

與分離樣品所帶電荷成正比，與樣品相對(duì)分子質(zhì)量成反比。電場(chǎng)強(qiáng)度

電壓越高，帶點(diǎn)粒子移動(dòng)越快。緩沖液的性質(zhì)

緩沖液的PH值距等電點(diǎn)越遠(yuǎn)指點(diǎn)所帶靜電荷越多，遷移速度越快；反之越慢。離子強(qiáng)度等于1/2∑cizi2支持介質(zhì)

理想電泳支持介質(zhì)應(yīng)是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、不帶電荷、對(duì)被分離物質(zhì)無吸附作用的惰性材料。溫度

影響電泳分離效果的因素第五頁，共三十三頁，2022年，8月28日電泳的分類1、根據(jù)固體支持物種類的不同

紙質(zhì)電泳

醋酸纖維素薄膜電泳瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳2、根據(jù)電泳裝置不同

薄膜電泳垂直板電泳平板電泳垂直圓盤電泳第六頁，共三十三頁，2022年，8月28日二、實(shí)驗(yàn)原理1.電泳的分類按分離目的：分析電泳和制備電泳按電場(chǎng)強(qiáng)度：常壓電泳和高壓電泳按電泳媒介：自由電泳和區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳（按支持介質(zhì)）：淀粉凝膠電泳濾紙電泳

醋酸纖維素薄膜電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳按支持介質(zhì)形式：水平式電泳、垂直電泳按緩沖液pH值：連續(xù)pH和不連續(xù)pH電泳第七頁，共三十三頁，2022年，8月28日2.概念

聚丙烯酰胺凝膠(PAG)是一種人工合成的凝膠，由單體丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在加速劑四甲基乙二胺(TEMED)和催化劑（過硫酸銨或核黃素）的作用下，聚合成含有酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長(zhǎng)鏈，相鄰的兩個(gè)鏈通過甲叉橋交聯(lián)，形成具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯酰胺凝膠電泳：以此凝膠作為支持物的電泳技術(shù)，稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡(jiǎn)稱PAGE。第八頁，共三十三頁，2022年，8月28日聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳一般可分成12～25個(gè)組分。因此適用于不同相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的分離，且分離效果好。根據(jù)有無濃縮效應(yīng)可分為：連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)，其中不連續(xù)系統(tǒng)因具有濃縮效應(yīng)，分離條帶清晰度及分辨率較佳應(yīng)用更為廣泛，本次試驗(yàn)應(yīng)用的為不連續(xù)系統(tǒng)。第九頁，共三十三頁，2022年，8月28日不連續(xù)系統(tǒng)成分pH值孔徑電泳緩沖液甘氨酸(慢離子)6.0樣品蛋白質(zhì)濃縮膠Cl-(快離子)6.7大分離膠Cl-(快離子)8.9小有效遷移率=遷移率×解離度氯離子>蛋白質(zhì)陰離子>甘氨酸陰離子第十頁，共三十三頁，2022年，8月28日聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)：凝膠透明，彈性、機(jī)械強(qiáng)度好；化學(xué)穩(wěn)定性高，幾乎無吸附和電滲作用；具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，起到分子篩作用?？梢酝ㄟ^控制單體濃度或者單體與交聯(lián)劑的比例聚合制成不同大小孔徑的凝膠，使分子篩效應(yīng)與電荷效應(yīng)結(jié)合起來，具有極高的分辨率；樣品不易擴(kuò)散，能自動(dòng)濃縮成很薄的樣品層；所用的樣品量小，分離效果好。

第十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日表面積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應(yīng)，條帶更清晰?？啥鄠€(gè)樣品的電泳膠板制作方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高。膠版薄而透明，可制成干板，便于長(zhǎng)期保存與掃描?？蛇M(jìn)行雙向電泳。血清蛋白在醋酸纖維素薄膜電泳中，只可以分離出5~6條區(qū)帶，而在聚丙烯酰胺凝膠電泳中可分離出數(shù)十條區(qū)帶。第十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日3.基本原理本實(shí)驗(yàn)利用聚丙烯酰胺凝膠作電泳支持物。電荷數(shù)和分子大小不一的各種血清蛋白質(zhì)通過濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)而被精細(xì)地分離。由于具有以上三種效應(yīng)，所以此方法分離效果好，分辨率高，血清蛋白在紙上電泳僅能分成5～7個(gè)組分，而在聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳中可分出10～30個(gè)組分。第十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日1.樣品膠：PH為6.7

2.濃縮膠：是大孔膠，PH為6.7的TRIS-HC1（省略）

3.分離膠；是小孔膠，PH為8.9

4.電極緩沖液：是PH為9.0的硼酸-硼砂緩沖液圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖(A為正面,B為剖面)第十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日第十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日分離機(jī)制（1）濃縮效應(yīng)——低電流壓縮效應(yīng)

無論哪種電泳，樣品加入后顆粒分散，不能從同一起點(diǎn)開始電泳，要想得到良好的分離效果，電泳開始前必須使樣品中各種成分同處于同一起跑線上，使顆粒同時(shí)開始電泳。

因此采用低電流壓縮，使樣品在達(dá)到小孔徑的分離膠時(shí)，已被濃縮成幾個(gè)微米的很薄的一層。分離膠分離膠第十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日（2）電荷效應(yīng)：在均一電勢(shì)梯度和pH的分離膠中，由于各種蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)不同，在同一pH的分離膠中所帶有效電荷不同，因而遷移率也就不同。根據(jù)電泳的基本原理，帶電荷越多，運(yùn)動(dòng)速率就越快，經(jīng)過一段時(shí)間的電泳分離，各種蛋白質(zhì)就按泳動(dòng)速率快慢順序排列成一個(gè)一個(gè)圓盤狀的蛋白質(zhì)區(qū)帶。電泳速度的大小：V

=QE6πR∝QRF=F′

電場(chǎng)力F=QE

摩擦力F′=6πRVQE=6πRV運(yùn)動(dòng)速度第十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日（3）分子篩效應(yīng)：由于分離膠的孔徑較小，各種蛋白質(zhì)分子由于分子大小和構(gòu)象不同，因而通過一定孔徑的分離膠時(shí)所受的摩擦力不同，受阻滯的程度不同。分子小，受阻滯小的走在前面；而分子大，受阻滯大的走在后邊，這樣就使大小、形狀不同的蛋白質(zhì)樣品得以分離。即使蛋白質(zhì)所帶的凈電荷相似，也會(huì)由于分子篩效應(yīng)被分開。第十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日凝膠過濾層析中的分子篩效應(yīng)大分子移動(dòng)快，小分子移動(dòng)慢第十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日三、主要試劑與儀器：儀器：電泳儀，圓盤電泳槽電泳玻璃管（8×0.5cm）試劑：分離膠緩沖液，單體交聯(lián)劑

電極緩沖液，樣品稀釋液

固定液，染色液，脫色液

新鮮羊血清，保存液第二十頁，共三十三頁，2022年，8月28日試劑編號(hào)試劑名稱配置14*分離膠緩沖液1mol/L鹽酸24.0mL/100mL,Tris18.2g/100mL(pH8.9)230%單體交聯(lián)劑丙烯酰胺30.0g與甲叉雙丙烯酰胺0.8g100mL3催化劑10%過硫酸銨（臨用前配置）4加速劑TEMED1mL加蒸餾水到10mL54*濃縮膠緩沖劑mol/L鹽酸48mL/100mL,Tris5.98g/100mL(pH6.7)610*電極緩沖劑甘氨酸28.8g與Tris6.0g加蒸餾水至100mL稀釋(pH8.3)臨用前十倍稀釋72*上樣緩沖劑溴酚藍(lán)0.05g20mL甘油，加5號(hào)試劑25mL，定溶至100mL8固定液三氯乙酸12.50g加蒸餾水至100mL9考馬斯亮藍(lán)R250染色液1.25g考馬斯亮藍(lán)R250,溶于227mL甲醇中加蒸餾水227mL冰醋酸46mL10脫色液甲醇:冰醋酸:水按3:1:6比例配合第二十一頁，共三十三頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)操作凝膠柱的準(zhǔn)備（凝膠溶液配制表見教材表4-4）取玻璃管，一段封口加入分離膠溶液(7cm)加入蒸餾水制備分離膠應(yīng)迅速為了使表面平整，與空氣隔絕靜置待凝膠聚合濃縮膠制備(1cm)吸取上表面蒸餾水待凝膠與水面的界面重新可辨切勿觸動(dòng)膠面參見分離膠加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速加入蒸餾水為了使表面平整，與空氣隔絕取玻璃管，一段封口加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速取玻璃管，一段封口加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速取玻璃管，一段封口加入蒸餾水為了使表面平整，與空氣隔絕加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速取玻璃管，一段封口第二十二頁，共三十三頁，2022年，8月28日四、操作步驟：1.凝膠柱的配制：

配膠-立柱-灌膠-水封-靜置-去水層（1）配膠——配制分離膠溶液。

分離膠緩沖液2.0mL

單體交聯(lián)劑4.34mL

蒸餾水13.48mL

催化劑0.2mL

加速劑0.05mL最后加

總體積20.07mL，丙烯酰胺濃度6.5%。第二十三頁，共三十三頁，2022年，8月28日（2）立柱：取8×0.5cm的玻璃管，一端用封口膜封好，垂直插入橡皮墊子中，并將之穩(wěn)定于架子上。（3）灌膠：用膠頭滴管吸取配置好的分離膠溶液，插入玻璃管底部，沿管壁緩緩注入膠液至離上端約1cm處。如有氣泡，可輕輕叩打玻管，排除氣泡。管的下方不要漏膠。

注意：灌膠完畢后立即清洗膠頭滴管和小燒杯。第二十四頁，共三十三頁，2022年，8月28日（4）水封：立即用膠頭滴管沿凝膠管內(nèi)壁在已加的膠液上邊加入約3~5mm高的蒸餾水。須緩慢進(jìn)行，防止膠液面被破壞或水層與膠層的混合。（5）靜置：40min，使其充分聚膠。膠柱上端有一明顯折光界面，表示凝膠已完成。（6）去水層：聚膠后，用注射器小心吸去膠液上的水層，并用濾紙將殘存的水分吸干。注意不要破壞膠面的完整性。第二十五頁，共三十三頁，2022年，8月28日2．樣品液的制備：取血清0.05ml，加入樣品稀釋液0.95mL，內(nèi)含溴酚藍(lán)作為示蹤染料，混勻備用。第二十六頁，共三十三頁，2022年，8月28日3．電泳

裝柱-加液-加樣-封液-電泳（1）裝柱：選擇合適的凝膠管，去掉下端的封口膜，垂直插入上層電泳槽的橡膠塞孔中，留有適當(dāng)?shù)母叨龋ㄒ鼓z表面露出橡皮塞），若有沒插滿的孔要用實(shí)心的橡皮塞堵塞。每個(gè)孔都要塞緊，防止漏液。第二十七頁，共三十三頁，2022年，8月28日裝柱

將凝膠管插入電泳槽槽底橡膠塞孔中，加入電極緩沖液與下電泳槽，隨后放入凝膠管及上槽，除氣泡(上電極槽以電極和凝膠管完全浸入為宜，下電極槽以凝膠管浸入3/5為宜)第二十八頁，共三十三頁，2022年，8月28日（2）加液：向下電泳槽加入適量的硼酸-硼砂緩沖溶液，沒過凝膠管的底部和電極，注意膠柱下方不要有氣泡。（3）加樣：用膠頭滴管吸取配好的樣品液，沿管壁緩慢加在凝膠柱上邊，加樣量以凝膠管內(nèi)樣品液高度2~3mm為宜。加樣槍不可插入過深，以免刺破凝膠，同時(shí)要緩慢、均勻，以免攪動(dòng)緩沖液引起樣品擴(kuò)散。（4）封液：用膠頭滴管吸取電極緩沖液，沿管壁慢慢加入凝膠管上方至加滿凝膠管，注意不要使緩沖液與樣品液混在一起。第二十九頁，共三十三頁，2022年，8月28日（5）然后向上電泳槽中加入電極緩沖液，使凝膠管的上端被緩沖液浸沒，隨后蓋上電泳槽的槽蓋。（6）電泳：將上層電泳槽的電極接電泳儀的負(fù)極，下槽