月季花藥培養(yǎng)(公開課)

花中皇后月季又稱“月月紅”，自然花期5至11月，開花連續(xù)不斷，通常扦插就可以成活。

課題2月季的花藥培養(yǎng)知識回顧花藥培養(yǎng)的原理（單倍體育種的過程？）花藥離體培養(yǎng)（N）單倍體植株（N）秋水仙素處理，使染色體加倍植株（2N）優(yōu)點：1明顯縮短育種年限2后代植株都為純合子。正常植株（2N）（一）被子植物的花粉發(fā)育（1）被子植物定義：凡是種子有果皮包被著，胚珠有子房壁包被著的植物，就叫做被子植物（綠色開花植物）1、被子植物和裸子植物（2）裸子植物定義：凡是胚珠裸露，外面沒有子房壁包被，種子外面沒有果皮包被的植物稱為裸子植物（無真正意義上的花）實例：玉米、大豆、梨、杏實例：松、杉、柏一、基礎(chǔ)知識花藥花絲（一）被子植物的花粉發(fā)育花絲花藥：囊狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)有很多花粉（一）被子植物的花粉發(fā)育雄蕊花藥藥隔：花藥中部，由薄壁細(xì)胞構(gòu)成，內(nèi)有維管束（疏導(dǎo)組織）花粉囊（4或2個）表皮纖維層（3）花藥的結(jié)構(gòu)：（4）被子植物的花粉發(fā)育①經(jīng)歷時期：四分體時期、單核期、雙核期等階段②花粉發(fā)育過程：花粉的概念:由花粉母細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成的單倍體的生殖細(xì)胞.小孢子母細(xì)胞（花粉母細(xì)胞）減數(shù)分裂4個小孢子（小孢子四分體時期）

1個小孢子（單核居中期）：這時的細(xì)胞含有濃厚的原生質(zhì)，核位于細(xì)胞中央稱為單核居中期②花粉發(fā)育過程：4個單倍體細(xì)胞連在一起，進(jìn)入單核期時（四分體的4個單倍體細(xì)胞彼此分離，各自形成具有4個單細(xì)胞核的花粉粒）有絲分裂1個小孢子（單核靠邊期）：隨著細(xì)胞不斷長大，細(xì)胞核由中央移向細(xì)胞一側(cè)稱為單核靠邊期花粉管細(xì)胞核生殖細(xì)胞核營養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞有絲分裂2個精子（基因型相同）雙核期兩個精子和一個營養(yǎng)核的基因型相同生殖細(xì)胞核與花粉管細(xì)胞核基因型相同；（一）被子植物的花粉發(fā)育減數(shù)分裂細(xì)胞生長小孢子母細(xì)胞或花粉母細(xì)胞2N4個小孢子N四分體時期1個小孢子N單核居中期單核靠邊期N單核花粉粒有絲分裂有絲分裂精子（花粉或花粉細(xì)胞）營養(yǎng)細(xì)胞核雙核花粉粒N×2三核花粉粒N×3（二）產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑1、體細(xì)胞胚（胚狀體）：在組織培養(yǎng)過程中，某些體細(xì)胞在形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)榕c合子發(fā)育成的胚非常相似的結(jié)構(gòu)，其發(fā)育過程亦與合子胚類似。（二）產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑2、產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑：通過花藥培養(yǎng)產(chǎn)生的花粉植株（單倍體植株）一般有兩種途徑：一種是花粉通過胚狀體階段發(fā)育為植株；另一種是花粉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上先形成愈傷組織，再將愈傷組織誘導(dǎo)分化成植株。①花藥中的花粉②花藥中的花粉脫分化胚狀體（花粉胚）分化叢芽脫分化愈傷組織再分化叢芽誘導(dǎo)生根移栽兩種途徑之間無絕對界限，主要取決于培養(yǎng)基中激素的種類及其濃度配比。誘導(dǎo)花粉植株能否成功及誘導(dǎo)成功率的高低，受多種因素影響，其中材料的選擇與培養(yǎng)基的組成是主要影響因素。（三）影響花藥培養(yǎng)的因素①不同植物的誘導(dǎo)成功率很不相同；②同一種植物的生理狀況對誘導(dǎo)成功率也有直接影響：花期早期時的花藥比后期的更容易產(chǎn)生花粉植株。一般月季的花藥培養(yǎng)時間選在5月初到5月中旬，即月季的初花期。選材是否成功是花藥培養(yǎng)成功的關(guān)鍵（1）選材1、材料的選擇：花期：花期一般指在一個生長季內(nèi)植株開花的時間段。比如某些種類的月季，從5月初一直到11月都連續(xù)開花。那么5月初就叫做該種月季的初花期或花期早期?；ㄆ谠缙诘幕ɡ贍I養(yǎng)狀態(tài)及生理狀態(tài)都比較好，能提高花粉誘導(dǎo)成功率。選材是否成功是花藥培養(yǎng)成功的關(guān)鍵（2）花藥培養(yǎng)時期的選擇：合適的花粉發(fā)育時期是提高誘導(dǎo)成功率的重要因素①原因：因為并不是任何時期的花粉都可以經(jīng)過培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體，花粉發(fā)育的過程中，只有某一個時期對離體刺激敏感。（三）影響花藥培養(yǎng)的因素一般來說，在單核期，細(xì)胞核由中央移向細(xì)胞一側(cè)的時期，花藥培養(yǎng)的成功率最高。即：最適合花藥培養(yǎng)的小孢子發(fā)育時期為單核靠邊期。②花藥時期選擇：單核靠邊期。選擇單核期以前的花藥接種，質(zhì)地幼嫩，極易破碎；選擇單核期之后的花藥接種，花瓣松動，又給材料的

消毒困難，且難以挑選到單核期的花藥。③其它時期選擇的缺點④單核期花藥的挑選：通常選擇完全未開放的花蕾。盛開的或略微開放的花，都不宜選作實驗材料。⑤選擇完全未開放花蕾的原因：花瓣松動后，微生物就可能侵入到花藥給材料的消毒帶來困難。旁欄思考：為什么花瓣松動會給消毒帶來困難？

可挑選到單核期的花,菌少、易消毒2、培養(yǎng)基的組成：培養(yǎng)基的組成會影響脫分化與再分化花藥培養(yǎng)基可能因植物的不同而有所變化如小麥中為N6馬鈴薯、月季中為MS油菜中為B5培養(yǎng)基月季花藥培養(yǎng)基配方：在1000mlMS培養(yǎng)基配方中添加2,4—D(0.4mg)、KT(0.2mg)、IAA(4mg)；調(diào)節(jié)PH至5.83、其他影響因素：如親本的生長條件、材料的低溫預(yù)處理以及接種密度對誘導(dǎo)成功率都有影響。月季花藥培養(yǎng)時的花粉粒最好是（）A、四分體時期B、二核或三核花粉粒C、單核期C實驗操作一、材料的選取二、材料的消毒三、接種和培養(yǎng)（一）材料選取

2、通過鏡檢來確定是否處于適宜的發(fā)育期。方法：醋酸洋紅法(將染色體染成紅色)

焙花青-鉻礬法(花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色)。1、從花藥看：從花粉看：

從花蕾看：花藥（載玻片上）→1%的醋酸洋紅1滴→用鑷柄將花藥搗碎，蓋上蓋玻片→鏡檢（花粉粒的細(xì)胞核被染成紅色）花藥（在卡諾氏固定液中處理20min）→取出，置于載玻片上→焙花青－鉻礬溶液染色→蓋上蓋玻片→鏡檢（花粉粒的細(xì)胞核被染成藍(lán)黑色）月季的初花期單核期完全未開放的（二）材料的消毒5、無菌水沖洗3～5次

花藥的外面有花萼、花瓣保護(hù)，通常處于無菌狀態(tài)1、花蕾用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精浸泡30秒2、無菌水清洗3、無菌吸水紙吸干花蕾表面的水分4、放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液中2～4分鐘（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈣溶液或飽和漂白粉溶液）（三）接種和培養(yǎng)

1滅菌后花蕾，要在

下除去萼片和花瓣，并立即將花藥接種到培養(yǎng)基上。

3通常每瓶接種花藥

，溫度控制在

左右，

。幼小植株形成后才

。

2在剝離花藥時，要盡量

（否則接種后，容易從受傷部位產(chǎn)生二倍體愈傷組織），同時還要徹底

，因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成。一般經(jīng)過20-30天培養(yǎng)后，會發(fā)現(xiàn)花藥開裂，長出愈傷組織或釋放出胚狀體。將愈傷組織及時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進(jìn)一步分化出再生植株。如果花藥開裂釋放出胚狀體，則一個花藥內(nèi)就會產(chǎn)生大量幼小的植株，必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開。無菌條件不損傷花藥去除花絲7-10個25℃不需要光照需要光照部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養(yǎng)胚狀體發(fā)育途徑愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養(yǎng)愈傷組織發(fā)育途徑部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥

鑒定和篩選：常常會出現(xiàn)染色體倍性的變化主要原因是花粉管核和生殖核融合造成的植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的比較項目植物組織培養(yǎng)花藥培養(yǎng)技術(shù)相同點1培養(yǎng)基配制方法、無菌技術(shù)及接種操作等基本相同。2都經(jīng)過了脫分化不同點1離體培養(yǎng)的外植體為體細(xì)胞。2有絲分裂的過程，染色體數(shù)量不變。1花粉是生殖細(xì)胞，得到的單倍體植株，弱小且高度不育。2秋水仙素處理，染色體加倍，恢復(fù)正常的染色體數(shù)，為純種。謝謝練習(xí)：小麥高桿（D）對矮桿（d）為顯性，抗銹?。═）對不抗銹?。╰）為顯性，現(xiàn)有高桿抗銹病和矮桿不抗病的兩種純合體，要獲得矮桿抗銹病的良種，可用雜交育種和單倍體育種法，步驟如下：

高桿抗銹?。―DTT）×矮稈不抗銹?。╠dtt）

F1：的基因型和表現(xiàn)型

a各種配子的種類

a

↓符合要求的單倍體的基因型