模塊二光合色素的提取、分離

光合色素的提取、理化性質(zhì)

分離、吸收光譜及含量的測定模塊二模塊實驗2/3/2023實驗背景１２３４５2/3/2023Caution!I光合色素的提取與理化性質(zhì)2/3/2023I光合色素的提取與理化性質(zhì)2/3/2023實驗?zāi)康恼莆展夂仙氐奶崛》椒ㄒ约傲私庥嘘P(guān)的理化性質(zhì)。實驗原理光合色素能溶于具有一定極性的有機溶劑，如丙酮、乙醇等。提取液中無任何電子受體，因此可以觀察熒光現(xiàn)象。離體葉綠素在有氧氣和光照條件下，發(fā)生光氧化作用，結(jié)構(gòu)遭到破壞，形成加氧葉綠素等產(chǎn)物。葉綠素是一種雙羧酸酯，可以發(fā)生皂化反應(yīng)。葉綠素分子中Mg2+與仆啉環(huán)結(jié)合不穩(wěn)定，可以被H+、Cu2+、Zn2+等離子所取代。I光合色素的提取與理化性質(zhì)2/3/2023實驗儀器及藥品材料：小桐子葉片方法及步驟

光合色素的提取：將植物葉片洗凈并用濾紙洗干，取1/2片葉片，放入研缽中并加入少許CaCO3和石英砂及5ml丙酮，充分研磨，再加入10ml丙酮，研磨，靜止片刻，上清液過濾于三角瓶中，待用。I光合色素的提取與理化性質(zhì)2/3/2023觀察熒光現(xiàn)象：與光線垂直的方向觀察色素顏色。光破壞作用：1ml色素提取液于室內(nèi)，1ml于太陽光下，30min后觀察顏色變化。I光合色素的提取與理化性質(zhì)2/3/2023皂化反應(yīng)：取一支試管，加入色素提取液2.5ml，再加入30%KOH甲醇溶液1ml，搖勻，再加入苯2.5ml，輕輕搖動，沿試管壁慢慢加入自來水1ml，輕輕搖動后觀察，注意觀察整個過程顏色的變化。取代反應(yīng)：取一支試管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液變?yōu)辄S褐色。倒出一半，加入少許醋酸銅粉末，酒精燈上加熱，與另一半比較顏色的差異。I光合色素的提取與理化性質(zhì)2/3/2023吸收光譜的變化：皂化和取代反應(yīng)后的色素進(jìn)行吸收光譜分析（見II）。結(jié)果與討論

1、認(rèn)真記錄觀察到的結(jié)果（顏色變化？分幾層？為什么？），并加以討論。

思考題

1、為什么在皂化反應(yīng)中只能用20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH水溶液？I光合色素的提取與理化性質(zhì)2/3/2023實驗?zāi)康恼莆展夂仙氐姆蛛x方法以及了解有關(guān)的吸收光譜。實驗原理光合色素能溶于具有一定極性的有機溶劑，如丙酮、乙醇等。不同光合色素的分子量、分子結(jié)構(gòu)、極性、溶解度、支持物對它們的吸附力等不同，因而分配系數(shù)不同，故彼此可以分開。葉綠素的卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)對光有很強的吸收，主要是紅光和藍(lán)紫光。II光合色素的分離與吸收光譜2/3/2023實驗儀器及藥品材料：菠菜葉片方法及步驟

光合色素的提取：將植物葉片洗凈并用濾紙洗干，取1/3片葉片，放入研缽中并加入少許CaCO3和石英砂及5ml丙酮，充分研磨，再加入10ml丙酮，研磨，靜止片刻，上清液過濾于三角瓶中，待用。II光合色素的分離與吸收光譜2/3/2023光合色素分離：剪取適當(dāng)長度和寬度的濾紙條→用上行紙層析法分離色素→啟動劑：石油醚：丙酮：苯=10：2：1。啟動劑II光合色素的分離與吸收光譜距離2/3/2023吸收光譜的測定：光合色素的吸收光譜：取色素溶液1mL，加入丙酮3mL，搖勻后在分光光度計上400到700nm處每隔10nm進(jìn)行掃描。各色素的吸收光譜：上述層析出的3~4種色素，分別剪下后溶于3mL丙酮中，按上述方法掃描。II光合色素的分離與吸收光譜2/3/2023結(jié)果與討論

1、畫出你的層析結(jié)果，并加以分析。

2、總光合色素和各光合色素的吸收光譜有何不同，為什么？思考題

1、光合色素的吸收光譜對我們理解光合作用有何意義？

2、試論述高等植物光合色素的種類和生理功能II光合色素的分離與吸收光譜2/3/2023III光合色素含量的測定2/3/2023K652=34.5III光合色素含量的測定2/3/2023實驗?zāi)康恼莆沼梅止夤舛扔嫓y定葉綠素含量的方法。實驗原理

混合液中的兩個或多各組分，只要它們的光譜吸收峰不互相重疊，仍然可以根據(jù)Lambert-Beer定律（A=kLC）求出各組分含量。Lambert定律：A=kL；Beer定律A=kC。葉綠素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分別為663nm、645nm，由此得出：見推導(dǎo)過程

Ca=12.7A663–2.69A645；Cb=22.9A645–4.68A663

Ca+b=8.02A663+20.20A645實驗儀器及藥品實驗材料：植物葉片III光合色素含量的測定2/3/2023A663=Ca.ka1+Cb.kb1A645=Cb.kb2+Ca.ka2

分光光度計測出，故求二元一次方程組可得到此公式。k——比吸收系數(shù)。即溶劑和波長不變的情況下，當(dāng)物質(zhì)的濃度(C)為1g/L(0.1%)，比色皿的直徑(光徑，L)為1cm時所測出的吸光度即為比吸收系數(shù)。故其單位為：ε——摩爾吸收系數(shù)。即溶劑和波長不變的情況下，當(dāng)物質(zhì)的濃度(C)為1mol/L，比色皿的直徑(光徑，L)為1cm時所測出的吸光度即為摩爾吸收系數(shù)。故其單位為：由于k是一個常數(shù)，而A可以通過III光合色素含量的測定2/3/2023方法及步驟方法一：快速測定法由于葉綠素a、b在652nm處有共同吸收，k=34.5Lg-1.cm-1?？芍苯佑帽銛y式葉綠素測定儀測定植物葉片的葉綠素含量，最后濃度單位為mg/dm2方法二:分光光度計法色素提?。簩⑸鲜鲋参锶~片洗凈并用濾紙吸干，準(zhǔn)確稱取已知Φ的葉圓片0.05g左右，加入少許CaCO3和石英砂及80%丙酮2ml，充分研磨，轉(zhuǎn)入離心管中（離心機使用），再用5ml80%丙酮洗研缽，轉(zhuǎn)入離心管中，平衡，5000rpm離心10min,記錄上清液體積，取1ml稀釋到4ml。測定：以1cm比色皿分別測定A663、A645。使A控制在0.1~0.8之間。III光合色素含量的測定2/3/2023結(jié)果與討論

1、根據(jù)原理中計算出三類色素的濃度（mg/L）。

2、根據(jù)公式

分別計算出各種植物葉片色素含量。思考題

1、一般正常的植物葉片，Chla/Chlb=3/1，你所測定的結(jié)果符合此比例嗎？為什么？

2、兩種測定方法含量有何不同？為什么？

3、怎樣把方法一中的葉綠素含量mg/dm2轉(zhuǎn)換為方法二中的mg/gFW？怎樣測定不同形態(tài)的植物葉片的葉面積？Chlcontent=

(mg.g-1FW)III光合色素含量的測定2/3/2023附1.葉面積的計算選取單位面積重量是一個常數(shù)的打印紙如A4或16K。一般A4打印紙為70~105GSM（g/m2）。用鉛筆輕輕地沿著葉緣在A4紙上劃線。用剪刀沿著葉緣剪下A4紙。稱所剪下的A4紙的重量W(g)。計算：附2.高速冷凍離心機的使用方法III光合色素含量的測定2/3/2023溫度調(diào)節(jié)1、插上電源插座2、按T接通電源3、按功能鍵調(diào)節(jié)溫度上限4、按功能鍵調(diào)節(jié)溫度下限5、按功能鍵顯示目前溫度III光合色素含量的測定2/3/20234、按功能鍵把Cd47改為Cd59