第七章酶工程

學習目的

初步掌握酶的發(fā)酵生產和分離純化的大致流程以及酶制劑的保存法。對酶的固定化、酶的修飾改造和主要的酶反應器類型有一定的認識。了解生物傳感器及酶對現(xiàn)代人類生活的影響。第七章酶工程

1、酶工程的發(fā)展趨勢

隨著生物技術的發(fā)展，酶工程將引起發(fā)酵工業(yè)和化學合成工業(yè)的巨大變革。21世紀酶工程的熱點和前題，可能包括基因工程和蛋白質工程的應用，人工合成酶和模擬酶、核酸酶和抗體酶，分子酶學，酶的定向固定術，雜交酶，分子發(fā)動機，酶化學技術，非水酶學，糖生物學和糖基轉移酶，酶標藥物，端粒酶，極端環(huán)境微生物和不可培養(yǎng)微生物的新酶種，酶在環(huán)境保護方面的應用等。

一、引言細胞融合

動植物細胞細胞融合物理化學誘度野生菌株采集基因工程細胞微生物培養(yǎng)基空氣

發(fā)酵罐能量發(fā)酵液預處理

廢料酶分離純化酶制劑菌體酶提取分離

固定化酶酶的化學修飾可溶性酶吸附色埋交聯(lián)化學連

逆膠束酶酶電極

酶熱敏電阻酶反應器產品回收工藝

廢料

輕工食品工業(yè)醫(yī)藥分析生物工程產品

2、酶工程研究內容

二、酶的發(fā)酵生產

1、酶的來源從動植物組織中分離提取植物細胞培養(yǎng)產酶

動物細胞培養(yǎng)產酶

微生物發(fā)酵產酶

2、微生物作為酶生產來源的優(yōu)點生長繁殖快，生活周期短，產量高，酶比活很高；

培養(yǎng)方法簡單，原料來源豐富，經濟效益高；微生物菌株種類繁多，酶的品種齊全；可以通過誘導、誘變及基因工程等方法培育出新的產酶量高的菌種。3、優(yōu)良產酶菌種的篩選

（1）優(yōu)良的產酶菌種應具備的優(yōu)點繁殖快、產酶量高能在便宜的底物上生長良好產酶性能穩(wěn)定、菌株不易退化產生的酶容易分離純化（2）產酶菌種的篩選方法篩選步驟產酶菌株的檢測胞外酶的產酶菌株的檢測胞內酶的產酶菌株的檢測4、基因工程菌（細胞）的構建

構建基因工程菌的目標改善原有酶的各種性能擴充可安全使用的酶源

酶基因克隆及表達的基本步驟

能產生目的酶的生物

酶的純化總mRNA的純化

測定N端部分氨基酸序列mRNA

設計引物RT-PCR

與合適的載體重組、重組子篩選與鑒定

轉入工業(yè)生產用的宿主（工程菌或工程細胞），如米曲霉

酶的工業(yè)化生產

克隆酶基因的宿主-載體系統(tǒng)應具備的特性所希望的酶占細胞總蛋白量的比例要高;菌體容易大規(guī)模培養(yǎng)，生長無特殊要求；載體與宿主相容，且能在宿主中穩(wěn)定維持；宿主的蛋白酶盡可能少；宿主菌對人安全，不分泌毒素。

5、微生物酶的發(fā)酵生產（1）培養(yǎng)基

碳源氮源無機鹽類生長因子

pH值

（2）酶的發(fā)酵生產方式

固體發(fā)酵法

液體深層發(fā)酵法

溫度

通氣和攪拌

pH值

固體發(fā)酵車間（3

）提高酶產量的措施添加誘導物

酶的作用底物

酶的反應產物

酶的底物類似物

降低阻遏物濃度

表面活性劑

添加產酶促進劑

6、酶的分離純化

提取和分離純化酶時一般應注意的條件

溫度

pH值

鹽濃度

攪拌微生物污染

HPLC

（1）酶制劑的制備破碎細胞溶劑抽提離心分離濃縮干燥高速冷凍離心機（2）酶的純化與精制

根據酶分子大小和形狀的分離方法離心分離

差速離心速率區(qū)帶離心等密度梯度離心

超速冷凍離心機凝膠過濾原理介質的特性

類型工作范圍（相對分子質量）床體積/（ml/g干膠）葡聚糖凝膠

SephadexG-10<2002～3G-15<1502.5～3.5G-251000～6000

4～6G-501500～30000

9～11G-7530000～70000

12～15G-1004000～150000

15～30G-1505000～400000

20～30G-2005000～800000

30～40

葡聚糖/雙丙烯胺凝膠

SephacrylS-200

5000～250000S-30010000～1500000S-40020000～8000000透析與超濾

透析在純化過程中極為常用，通過透析可以除去酶液中的鹽類、有機溶劑、低分子質量的抑制劑等。超濾是指在一定壓力（正壓/負壓）下，將料液強制通過一定孔徑的濾膜以達到分離純化的目的，也可用于酶液的濃縮及脫色等。

根據酶分子電荷性質的分離方法離子交換層析

-O-CH2CH2N（C2H5)2+OH--O-CH2CH2N(C2H5)2OH

-O-CH2CH2N（C2H5）2+E-COO--O-CH2CH2N(C2H5)2+OH-

OHE-COO

-O-CH2CH2N(C2H5)2+Cl--O-CH2CH2N(C2H5)2+E-COO-

E-COOCl

離子交換原理示意圖原理

蛋白質純化過程常用的幾種離子交換劑

名稱種類解離基團交換當量陰離子交換劑DEAE-纖維素弱堿性二乙氨基乙基0.1～1.1

氨乙基纖維素弱堿性氨乙基－

DEAE-纖維素堿性稍強三乙氨基0.5～1.0DEAE-Sephacel

二乙氨基乙基1.3～1.5DEAE-Sephadex

弱堿性二乙氨基乙基3.0～4.0QAE-Sephadex

二乙氨基乙基2.6～3.4-2-羧丙基陽離子交換劑CM-纖維素弱酸性羧甲基－

CM-Sephadex

弱酸性羧甲基4～4.5

介質特性層析聚焦層析聚焦類似于等電聚焦電泳，但其連續(xù)的pH梯度是在固相離子交換載體上形成的。它既具有等電聚焦電泳的高分辨率，又具有柱內容量大的特點，具有較大的應用價值。

電泳由于不同蛋白質所帶凈電荷的大小和性質不同，在外電場作用下，其泳動方向和速率也不同，從而達到分離的目的。等電聚焦電泳它屬于移動界線電泳法。電泳儀根據酶分子專一性結合的分離方法親和層析利用酶分子的專一性結合位點或特異的結構性質來達到分離的目的；它具有結合效率高、分離速度快的特點。染料配體親和層析利用染料與酶或酶的輔基特異結合的特點，達到對酶的分離。由于染料分子與被純化的酶沒有任何生物學關系，因此嚴格地說只能被稱之為假親和層析。

共價層析利用層析介質與被分離的酶之間形成共價鍵而達到分離的目的。層析分離5.2.2.4根據分配系數(shù)的分離方法

雙水相萃取分離某些聚合物與一些無機鹽或另一種聚合物相混合，當濃度達到一定范圍時，體系會自動分為兩相，由于生物活性物質在兩相中具有不同的分配比，經過反復處理則可達到分離的目的，這種分離方法稱為雙水相萃取分離。

聚合物P、Q和水系統(tǒng)的相圖示意圖

幾種常用的兩水相系統(tǒng)聚丙二醇-聚乙二醇聚丙二醇-聚乙烯醇非離子型聚合物-聚丙二醇-葡聚糖非離子型聚合物聚乙二醇-聚乙烯醇聚乙二醇-葡聚糖

聚乙二醇-聚乙烯吡咯烷酮帶電荷聚電解質-DEAE-葡聚糖-HCl-聚丙二醇NaCl非離子型聚合物-聚乙二醇Li2SO4兩種聚電解質羧甲基葡聚糖鈉鹽-羧甲基纖維素鈉鹽聚乙二醇-磷酸鉀聚合物-無機鹽聚乙二醇

-硫酸銨聚乙二醇

-硫酸鈉5.2.3酶的純度與酶活力

酶的純度

酶的活力酶的比活力5.2.4

酶制劑的保存

溫度

緩沖液

氧化/還原

蛋白質的濃度及純度

超低溫冰箱5.3酶分子的改造5.3.1

酶分子修飾酶分子化學修飾酶分子化學修飾的目的

制備修飾酶的目的

提高酶活力改進酶的穩(wěn)定性允許酶在一個變化的環(huán)境中起作用改變最適pH值或最適溫度改變酶的特異性使它能催化不同的底物改變催化反應類型提高催化過程的反應效率（引自Smith，1996）酶分子化學修飾應注意的事項

修飾劑的要求酶性質的了解反應條件的選擇酶修飾劑的類型

修飾酶的特性

天然酶和修飾酶的特性比較——耐溫特性比較

酶修飾劑處理條件殘留酶活/％天然酶修飾酶

?-葡萄糖苷酶右旋糖酐60℃/40min4182

尿酸酶人血清白蛋白37℃/48h5095

尿激酶聚丙烯酰胺17℃/2d50100-丙烯酸糜蛋白酶肝素37℃/6h080（24h）糜蛋白酶聚（-乙烯75℃/117h61100

吡咯烷酮)天然酶和修飾酶的特性比較——最適pH比較

酶修飾劑天然酶修飾酶

尿酸酶（豬肝）白蛋白10.57.4~8.5

尿激酶（豬肝）聚乙二醇8.29.0

天然酶和修飾酶的特性比較——其他特性比較

酶修飾劑特性天然酶修飾酶胰蛋白酶右旋糖酐抗失活因子抗自身水解抗大豆蛋白酶抑制劑抗尿素胰蛋白酶聚乙二醇抗失活因子抗大豆蛋白酶抑制劑 抗原性抗原性消除尿酸酶白蛋白抗失活因子抗胰酶 抗原性抗原性消除體內半衰期4h20h

尿激酶白蛋白抗失活因子抗胃蛋白酶抗胎盤抑制劑 體內半衰期

20min90min

酶蛋白質工程的程序圖三維結構新蛋白質設計藍圖蛋白質利用基因產物分子模型

X射線晶體衍射基因誘變克隆和表達開發(fā)5.3.2酶的蛋白質工程酶蛋白質工程的策略分子裁減

定點突變

對隨機誘變的基因庫進行定向的篩選和選擇

雜交酶（hybridenzyme）

——利用高度同源的酶之間的雜交

——創(chuàng)造具有新活性的雜交酶

5.3.3生物酶的人工模擬

生物酶的人工模擬模擬酶抗體酶（abzyme）印跡酶

——分子印跡酶

——生物印跡酶

分子印跡聚合物的制備流程圖5.4生物催化劑的固定化

酶固定化的目的

固定化

共固定化

聯(lián)合固定化

酶與微生物細胞聯(lián)合固定化體系的應用聯(lián)合固定化生物催化劑微生物酶應用領域參考文獻黑曲霉過氧化氫酶生產葡萄糖酸姜明等生物化學與生酵母纖維二糖酶生產乙醇物物理進展，1991，酵母胃蛋白酶葡萄汁發(fā)酵18（1）：26

釀酒酵母果膠酶葡萄汁發(fā)酵面包酵母β-葡萄糖苷酶生產乙醇隋德新，生物科學動態(tài)，釀酒酵母β-半乳糖苷酶生產乙醇1988，（3）：19

酵母糖化酶啤酒釀造釀酒酵母木糖異構酶木糖發(fā)酵大腸桿菌葡萄糖氧化酶牛奶防腐

淀粉水解酶淀粉泡盛曲霉葡萄糖

02

菌體運動發(fā)酵單孢菌 菌體 乙醇

泡盛曲霉（Asp.awamori）和運動發(fā)酵單菌（Z.mobilis）聯(lián)合固定化體系代謝模式

酶工程

5.4生物催化劑的固定化

定向固定化每一個酶蛋白分子通過其一個特定的位點以可重復的方式進行固定化；蛋白質的定向固定化技術有利于進一步研究蛋白質結構；這種固定化技術可以借助一個與酶蛋白的酶活性無關或影響很小的氨基酸來實現(xiàn)。

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5.4生物催化劑的固定化

5.4.1酶的固定化方法酶固定化方法分類還沒有一種固定化方法可以普遍地適用于每一種酶。特定的酶要根據具體的應用目的選擇特定的固定化方法。已建立的固定化方法，大致可分為三類：載體結合法、交聯(lián)法和包埋法。

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5.4生物催化劑的固定化

酶固定化方法示意圖（引自戚以政等,1996）（1）離子結合；（2）共價結合；（3）交聯(lián)；（4）聚合物包埋；

（5）疏水相互作用；（6）脂質體包埋；（7）微膠囊

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5.4.1酶的固定化方法

5.4.1.1載體結合法物理吸附法：是制備固定化酶最早采用的方法，它是以固體表面物理吸附為依據，使酶與水不溶性載體相接觸而達到酶吸附的目的。

離子結合法：該法是通過離子效應，將酶分子固定到含有離子交換基團的固相載體上。

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5.4.1酶的固定化方法螯合法：這是一種比較吸引人的技術，它主要是利用螯合作用將酶直接螯合到表面含過渡金屬化合物的載體上，具有較高的操作穩(wěn)定性。共價結合法：共價結合法是通過酶分子上的官能團，與載體表面上的反應基團發(fā)生化學反應形成共價鍵的一種固定化方法，是研究得最多的固定化方法之一。

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5.4.1.1載體結合法

5.4.1.2

共價交聯(lián)法共價交聯(lián)法是通過雙功能或多功能試劑，在酶分子間或酶分子和載體間形成共價鍵的連接方法。

5.4.1.3包埋法將酶包埋在高聚物凝膠網格中或高分子半透膜內的固定方法。前者又稱為凝膠包埋法，后者則稱為微囊法。

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5.4.1酶的固定化方法5.4.2細胞的固定化方法5.4.2.1包埋法

將細胞包埋在多微孔載體內部制備固定化細胞的方法稱包埋法，可分為凝膠包埋法、纖維包埋法和微膠囊包埋法。5.4.2.2吸附法

主要是利用細胞與載體之間的吸引力，使細胞固定在載體上。

酶工程

5.4生物催化劑的固定化

5.4.3固定化酶（細胞）的性質

酶活力的變化

酶穩(wěn)定性提高

最適pH值的變化最適溫度的變化

動力學常數(shù)的變化

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5.4生物催化劑的固定化

5.4.4固定化酶（細胞）的指標

相對酶活力

酶的活力回收率

固定化酶的半衰期

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5.4生物催化劑的固定化

5.5酶反應器

酶反應器的定義

以酶為催化劑進行反應所需要的設備稱為酶反應器。

酶工程

5酶工程

酶反應器的分類

按酶的狀態(tài)來分，酶反應器有兩種類型：一類是直接應用游離酶進行反應的均相酶反應器；另一類是應用固定化酶進行反應的非均相酶反應器。若按其結構和功能來分，則有許多類型。

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5.5酶反應器

酶反應器的類型

(引自戚以政等，1996)（1）間歇式攪拌罐；（2）連續(xù)式攪拌罐；（3）多級連續(xù)攪拌罐；（4）填充床（固定床）；（5）帶循環(huán)的固定床；（6）列管式固定床；（7）流化床；（8）攪拌罐-超濾器聯(lián)合裝置；（9）多釜串聯(lián)半連續(xù)操作；（10）環(huán)流反應器；（11）螺旋卷式生物膜反應器

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5.5酶反應器

選擇反應器型式必須綜合考慮各種因素

催化劑的形狀和大小催化劑的機械強度和比重反應操作的要求（如pH值是否可控制）對付雜菌污染的措施反應動力學方程的類型底物（溶液）的性質催化劑的再生、更換的難易反應器內液體的塔存量與催化劑表面積之比傳質特性反應器制造成本和運行成本

酶工程

5.5酶反應器5.5.1酶反應器的基本類型

5.5.1.1

攪拌罐型反應器

帶有機械攪拌裝置的反應罐稱攪拌罐型反應器

酶工程

5.5酶反應器間歇式攪拌罐連續(xù)式攪拌罐多級連續(xù)攪拌罐5.5.1.2固定床型反應器

把催化劑填充在固定床（填充床）中的反應器叫做固定床型反應器。填充床（固定床）帶循環(huán)的固定床列管式固定床

酶工程

5.5.1酶反應器的基本類型5.5.1.3流化床型反應器

流化床型反應器是一種裝有較小顆粒的垂直塔式反應器。底物以一定的流速從下向上流過，使固定化酶顆粒在流體中維持懸浮狀態(tài)并進行反應，這時的固定化顆粒和流體可以被看作是均勻混合的流體。

流化床型反應器

酶工程

5.5.1酶反應器的基本類型5.5.1.4膜式反應器

膜反應器是利用膜的分離功能，同時完成反應和分離過程的反應器，包括用固定化酶膜組裝的平板狀或螺旋卷型反器、轉盤反應器和空心酶管、中空纖維膜反應器等。螺旋卷式生物膜反應器攪拌罐-超濾器聯(lián)合裝置

酶工程

5.5.1酶反應器的基本類型

第二代酶反應器的主要類型含輔因子的酶反應器兩相或多相酶反應器固定化多酶反應器

酶工程

5.5.1酶反應器的基本類型酶反應器5.5.2酶反應器的設計原則底物的酶促反應動力學以及溫度、壓力、pH值等操作參數(shù)對此特性的影響；反應器的類型和反應器內流體的流動狀態(tài)及傳熱特性；需要的生產量和生產工藝流程。

酶工程

5.5酶反應器

5.5.3酶反應器的性能評價

空時：空時是指底物在反應器中的停留時間。

轉化率：轉化率是指每克底物中有多少被轉化為產物。

酶反應器的生產強度：酶反應器的生產強度是指每小時每升反應器體積所生產的產品克數(shù)。

酶工程

5.5酶反應器5.5.4酶反應器的操作5.5.4.1酶反應器的微生物污染的預防用酶反應器制造食品和生產藥品時，生產環(huán)境通常須保持無菌，并應在必要的衛(wèi)生條件下進行操作，因為微生物的污染不僅會堵塞反應柱，而且它們產生的酶和代謝物，還會進一步使產物降解或產生令人厭惡的副產物，甚至能使固定化酶活性載體降解。

酶工程

5.5酶反應器5.5.4.2酶反應器中流動方式的控制

攪拌速度的控制

柱壓降的控制壅塞的控制

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5.5.4酶反應器的操作酶反應器5.5.4.3酶反應器恒定生產能力的控制控制反應器的流速提高溫度柱反應器串聯(lián)

酶工程

5.5.4酶反應器的操作生物反應器生物傳感器的簡圖5.6.1生物傳感器的原理

酶工程

5酶工程

5.6生物傳感器

生物傳感器的分子識別元件

分子識別元件生物活性材料酶膜各種酶類

全細胞膜細菌、真菌、動植物細胞

組織膜動植物組織切片

細胞器膜線粒體、葉綠體等細胞器

（引自張先恩，1991）

酶工程

5.6生物傳感器

生物學反應信息和換能器的選擇生物學信息換能器的選擇離子變化電流型或電位型的離子選擇電極、阻抗計質子變化離子選擇電極、場效應晶體管氣體分壓變化氣敏電極、場效應晶體管熱效應熱敏元件光效應光纖、光敏管、熒光計色效應光纖、光敏管質量變化壓電效應電荷密度變化阻抗計、導納、場效應晶體管溶液密度變化表面等離子共振

（引自張先恩，1991）

酶工程

5.6生物傳感器

5.6.2

生物傳感器的分類

5.6.2.1

酶傳感器利用酶的催化作用，在常溫常壓下將糖類、醇類、有機酸、氨基酸等生物分子氧化或分解，然后通過換能器將反應過程中化學物質的變化轉變?yōu)殡娦盘栍涗浵聛?，進而推導出相應的生物分子的濃度。

酶工程

5.6生物傳感器

葡萄糖氧化酶電極（引自郭勇,1994）

酶工程

5.6.2.1酶傳感器

5.6.2.2組織傳感器利用動植物組織中多酶系統(tǒng)的催化作用來識別分子。由于所用的酶存在于天然組織內，無須進行人工提取純化，因而較為穩(wěn)定，制備成的傳感器壽命較長。5.6.2.3微生物傳感器應用細胞固定化技術，將各種微生物固定在膜上的生物傳感器。它主要可分為兩大類，一類是利用微生物的呼吸作用；另一類是利用微生物內所含的酶。

酶工程

5.6.2生物傳感器的分類

5.6.2.4免疫傳感器利用抗體與抗原之間的高特異性而研制的。它克服了放射免疫法的缺點，無須使用昂貴的儀器和進行復雜的放射性廢物處理。5.6.2.5場效應晶體管（FET）生物傳感器將生物技術與晶體管工藝結合的第三代生物傳感器。它具有所需酶或抗體量小的優(yōu)點，但由于器件的成品率很低，目前實際應用不大。