第10章外源基因表達與基因工程藥物

外源基因表達與基因工程藥物第十章目錄第一節(jié)

概述

一、基因表達基本原理

基因表達指基因通過轉(zhuǎn)錄和翻譯而產(chǎn)生其蛋白產(chǎn)物,或轉(zhuǎn)錄后直接產(chǎn)生其RNA產(chǎn)物的過程。外源基因表達利用細胞內(nèi)相關(guān)酶系及其調(diào)控系統(tǒng)，將外源基因轉(zhuǎn)錄成mRNA，進而翻譯成肽鏈或加工成活性蛋白質(zhì)的過程?；蚬こ蹋╣eneticengineering)為實現(xiàn)基因克隆所采用的方法和相關(guān)技術(shù)，包括重組DNA技術(shù)及操作過程，表達產(chǎn)物的后續(xù)處理過程和技術(shù)（如蛋白質(zhì)分離純化、修飾和加工技術(shù)、中試和擴大生產(chǎn)規(guī)模的工藝和技術(shù)等）統(tǒng)稱為基因工程。生物技術(shù)工程:

基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細胞工程等目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）轉(zhuǎn)錄與翻譯各有兩種模式：原核生物與真核生物轉(zhuǎn)錄一、基因表達基本原理

原核生物真核生物轉(zhuǎn)錄全長轉(zhuǎn)錄，無需RNA加工無活性前體需剪輯、加工修飾后轉(zhuǎn)變成具有翻譯模板的活性形式翻譯轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)，mRNA直接作模板指導肽鏈合成；可編碼多條肽鏈轉(zhuǎn)錄與翻譯分隔進行；編碼一條肽鏈宿主細胞表達的外源蛋白的屬性涉及：①目標蛋白是否是糖基化蛋白②真核生物蛋白三維結(jié)構(gòu)的復雜程度二、基因表達基本類型

根據(jù)外源基因表達宿主細胞原核表達系統(tǒng)包括大腸桿菌、芽孢桿菌系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)包括酵母、昆蟲、哺乳動物細胞根據(jù)表達產(chǎn)物在宿主細胞的部位胞內(nèi)表達：表達產(chǎn)物存在于胞質(zhì)中定位表達：通過定位系統(tǒng)分布于周間質(zhì)等特定位置分泌表達：通過分泌分泌到細胞外根據(jù)表達產(chǎn)物的溶解狀態(tài)可溶性表達：溶解形式存在包涵體表達：以包涵體形式存在根據(jù)表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)狀況非融合表達融合表達：N-端或C-端連接一個特定功能肽鏈第二節(jié)

外源基因表達基本過程

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1865年

G.J.Mendel的豌豆雜交試驗。1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗。1973年美國斯坦福大學的科學家構(gòu)建第一個重組DNA分子。1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學上重要的藥物。1980年開始建造第一家應用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉。一、目的基因的獲取化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。RT-PCR擴增，從總RNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄擴增PCR擴增從cDNA文庫(cDNAlibrary)或基因組文庫(genomicDNAlibrary)擴增雜交技術(shù)從cDNA文庫或基因組文庫篩選利用篩淘技術(shù)，從各類型文庫中篩淘化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。組織或細胞染色體DNA基因片段克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫獲取目的基因限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫用隨機切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫mRNAcDNA

雙鏈cDNA

重組DNA分子cDNA文庫

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復制從cDNA文庫獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT（一）載體定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子，是實現(xiàn)目的基因在宿主細胞的復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后加工修飾的保障。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA二、目的基因與表達載體的重組載體的共同特征本身是復制子，能自主復制；分子量小，易于操作和易于得到完整分子具有選擇性標記，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；有一定的非必要區(qū)（即插入外源DNA不影響其復制的區(qū)段。表達載體具備與宿主細胞相適應的啟動子、前導序列和增強子等調(diào)控元件多克隆位點ori復制起始區(qū)抗性基因或遺傳標記Amppolylinker載體基本組成克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。1.質(zhì)粒

(plasmid)特點能在宿主細胞內(nèi)獨立自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。某些細胞中獨立于染色體以外共價閉合環(huán)狀的小分子雙鏈DNA，它具有在宿主細胞內(nèi)獨立復制的能力，并可在宿主細胞分裂時隨染色體一道分配到子細胞中。

λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)

λgt系列（插入型，適用cDNA克隆）

EMBL系列（置換型，適用基因組克?。┦删w(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）

M13mp系列

pUC系列粘性質(zhì)粒(cosmid)酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)

細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)

動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他需要的工具酶

限制性核酸內(nèi)切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶（二）重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ定義：與甲基化酶共同構(gòu)成細菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）分類：作用：第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin

dⅢ屬

系

株序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口

：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG呈二元旋轉(zhuǎn)對稱BamHⅠ切割位點：雙鏈DNA的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生5’-磷酸基，3’羥基末端切割長度：對于識別4個核苷酸的酶，每44長度出現(xiàn)一個靶順序?qū)τ谧R別6個核苷酸的酶，每46長度出現(xiàn)一個靶順序BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱異源同工酶或同裂酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ異源同工酶：有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBg

lⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶名稱識別序列及切割位點名稱識別序列及切割點切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’Bgl

Ⅱ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’MboⅠ

5’…▼GATC...3’NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:Apa

Ⅰ

5’…GGGCC▼C...3’Hae

Ⅱ

5’…PuGCGC▼Py...3’Kpn

Ⅰ

5’…GGTAC▼C...3’Pst

Ⅰ

5’…CTGCA▼G...3’Sph

Ⅰ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:Alu

Ⅰ

5’…AG▼CT...3’EcoR

Ⅴ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’限制性內(nèi)切核酸酶（三）外源基因與載體的連接方式：(1)同一限制酶切位點連接

(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接粘性末端連接工具酶：DNA連接酶催化形成3‘，5‘-磷酸二酯鍵，實現(xiàn)基因與載體的共價連接，即重組BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。平端連接

限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端適用于：目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連宿主細胞條件：限制酶和重組酶缺陷易于重組子導入遺傳穩(wěn)定性好安全性高功能互補具有較好翻譯后加工機制蛋白水解酶基因缺陷或表達水平低

三、重組DNA導入宿主細胞及其篩選與確認導入方式：轉(zhuǎn)導（transduction)轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)轉(zhuǎn)導（Transduction）指噬菌體顆粒感染宿主細胞，通過特定的途徑，將噬菌體核酸注入宿主細胞內(nèi)的過程，并使噬菌體核酸在宿主細胞內(nèi)實現(xiàn)復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯或子代噬菌體的繁殖。實質(zhì)是：被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發(fā)生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組。λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)轉(zhuǎn)化（Transformation）指感受態(tài)細胞接納外源DNA分子的過程，并使其在宿主細胞內(nèi)實現(xiàn)復制、擴增、轉(zhuǎn)錄、翻譯（統(tǒng)稱表達）。實質(zhì)是：通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型。方式有兩種：二價金屬離子如Ca2+、Mn2+處理電轉(zhuǎn)化即電穿孔法如：細菌感受態(tài)制備、重組體轉(zhuǎn)化及篩選細菌感受態(tài)細胞的制備：CaCl2

處理法

受體細菌0-4℃0.1MCaCl2冰浴15-30min細菌處于感受態(tài)42℃，細胞熱休克細菌的細胞膜通透性增加重組DNA進入感受態(tài)細胞LB0.18M0.1MCaCl20.1MCaCl2H2O細胞膨脹：低滲環(huán)境胞膜收縮：低溫環(huán)境離子擴散：DNA-Ca2＋熱休克：42℃1LLB培養(yǎng)基:10g胰蛋白胨5g酵母提取物10gNaCl0.18M轉(zhuǎn)化

1.根據(jù)表型特征或遺傳標記篩選(1)

抗藥性標記選擇(2)藍白篩選2.噬菌體的溶菌性和溶源性3.利用核酸探針篩選4.限制性內(nèi)切核酸酶圖譜篩選5.PCR篩選6.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等（三）宿主細胞內(nèi)重組子的篩選與確認(插入失活法)

抗藥性標記選擇

α互補利用α互補原理篩選重組體pUC18

原位雜交

Southern印跡雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學方法重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為：

小結(jié)分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體

轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細胞篩篩選重組體

重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA

cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交表達體系的建立：表達載體的構(gòu)建受體細胞的建立表達產(chǎn)物的分離純化四、目的基因表達通過：1.目的DNA的有效轉(zhuǎn)錄2.mRNA的有效翻譯3.翻譯后的加工修飾標準：選擇標志 強啟動子翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點

E.coli表達體系的不足：不宜表達真核基因組DNA；不能加工表達的真核蛋白質(zhì)；表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

；很難表達大量可溶性蛋白。1.原核表達體系(E.coli表達體系最為常用)原核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以操縱子模式進行原核生物蛋白質(zhì)因子——操縱子(operon)

機制特異DNA序列編碼序列

啟動序列操縱序列

其他調(diào)節(jié)序列(promoter)(operator)操縱子模型的普遍性原核生物絕大多數(shù)基因按功能相關(guān)性成簇地串聯(lián)、密集于染色體上，共同組成一個轉(zhuǎn)錄單位──操縱子（operon）。一個操縱子只含一個啟動序列（promoter）及數(shù)個可轉(zhuǎn)錄的編碼基因。通常，這些編碼基因可轉(zhuǎn)錄出多順反子mRNA。原核基因的協(xié)調(diào)表達就是通過調(diào)控單個啟動基因的活性來完成的。是RNA聚合酶結(jié)合并啟動轉(zhuǎn)錄的特異DNA序列。1、啟動序列RNA轉(zhuǎn)錄起始-35區(qū)-10區(qū)TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrp

tRNATyrlacrecAAra

BAD

TTGACA

TATAAT共有序列圖13-1五種E.coli啟動序列的共有序列2、操縱序列

——阻遏蛋白(repressor)的結(jié)合位點當操縱序列結(jié)合有阻遏蛋白時，會阻礙RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合，或是RNA聚合酶不能沿DNA向前移動，阻礙轉(zhuǎn)錄。啟動序列編碼序列操縱序列pol阻遏蛋白（一）乳糖操縱子(lac

operon)的結(jié)構(gòu)

調(diào)控區(qū)CAP結(jié)合位點啟動序列操縱序列

結(jié)構(gòu)基因Z：β-半乳糖苷酶Y：透酶A：乙?；D(zhuǎn)移酶ZYAOPDNAmRNA阻遏蛋白IDNAZYAOPpol沒有乳糖存在時阻遏基因阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)mRNA阻遏蛋白有乳糖存在時IDNAZYAOPpol啟動轉(zhuǎn)錄mRNA乳糖半乳糖β-半乳糖苷酶圖13-4lac

操縱子與阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)原核生物mRNA作為模板進行翻譯的效率與強度與SD序列的堿基排序和組成以及其與起始密碼子ATG的間隔相關(guān)：在各種mRNA起始AUG上游約8～13核苷酸部位，存在一段由4～9個核苷酸組成的一致序列，富含嘌呤堿基，如-AGGAGG-，稱為Shine-Dalgarno序列(S-D序列)，又稱核蛋白體結(jié)合位點(ribosomalbindingsite,RBS)。一條多順反子mRNA序列上的每個基因編碼序列均擁有各自的S-D序列和起始AUG。S-D序列小亞基中的16S-rRNA3ˊ-端有一富含嘧啶堿基的短序列，如-UCCUCC-，通過與S-D序列堿基互補而使mRNA與小亞基結(jié)合。mRNA序列上緊接S-D序列后的小核苷酸序列，可被核蛋白體小亞基蛋白rpS-1識別并結(jié)合。大鼠胰島素原cDNA的表達和分泌 優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA

可適當修飾表達的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點：操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟轉(zhuǎn)染

——將表達載體導入真核細胞的過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染

DEAE葡聚糖介導轉(zhuǎn)染電穿孔脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染顯微注射2.真核表達體系（酵母、昆蟲、乳類動物細胞）真核基因順式作用元件影響基因轉(zhuǎn)錄活性啟動子真核基因啟動子是RNA聚合酶結(jié)合位點周圍的一組轉(zhuǎn)錄控制組件，至少包括一個轉(zhuǎn)錄起始點以及一個以上的功能組件。TATA盒GC盒CAAT盒CCAAT盒GC盒TATA盒轉(zhuǎn)錄起始點高等真核生物上游激活序列（UAS）TATA盒轉(zhuǎn)錄起始點酵母圖13-7真核基因啟動子的典型結(jié)構(gòu)增強子(enhancer)指遠離轉(zhuǎn)錄起始點、決定基因的時間、空間特異性、增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列。其發(fā)揮作用的方式通常與方向、距離無關(guān)。沉默子(silencer)某些基因的負性調(diào)節(jié)元件，當其結(jié)合特異蛋白因子時，對基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。新生多肽鏈不具備蛋白質(zhì)的生物學活性，必須經(jīng)過復雜的加工過程才能轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂刑烊粯?gòu)象的功能蛋白質(zhì)，這一加工過程稱為翻譯后修飾(posttranslationalmodification)。翻譯后修飾包括多肽鏈折疊為天然的三維構(gòu)象及對肽鏈一級結(jié)構(gòu)的修飾、空間結(jié)構(gòu)的修飾等。翻譯后修飾使得蛋白質(zhì)組成更加多樣化，從而使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)更大的復雜性。多肽鏈折疊為天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)新生肽鏈的折疊在肽鏈合成中、合成后完成，新生肽鏈N-端在核蛋白體上一出現(xiàn)，肽鏈的折疊即開始?？赡茈S著序列的不斷延伸肽鏈逐步折疊，產(chǎn)生正確的二級結(jié)構(gòu)、模序、結(jié)構(gòu)域到形成完整空間構(gòu)象。一般認為，多肽鏈自身氨基酸順序儲存著蛋白質(zhì)折疊的信息，即一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎。細胞中大多數(shù)天然蛋白質(zhì)折疊都不是自動完成，而需要其他酶和蛋白質(zhì)輔助。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)修飾主要是肽鍵水解和化學修飾

（一）肽鏈末端的修飾（二）個別氨基酸的共價修飾1．糖基化2．羥基化3．甲基化4．磷酸化5．二硫鍵形成6．親脂性修飾例：鴉片促黑皮質(zhì)素原(POMC)的水解修飾多肽鏈的水解修飾空間結(jié)構(gòu)的修飾結(jié)合蛋白質(zhì)合成后都需要結(jié)合相應輔基，才能成為具有功能活性的天然蛋白質(zhì)。具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)由兩條以上的肽鏈通過非共價鍵聚合，形成寡聚體(oligomer)。（一）通過非共價鍵亞基聚合形成具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)（二）輔基連接后形成完整的結(jié)合蛋白質(zhì)合成后蛋白質(zhì)可被靶向輸送至細胞特定部位蛋白質(zhì)在核蛋白體上合成后，必須分選出來，定向輸送到一個合適的部位才能行使各自的生物學功能。蛋白質(zhì)的靶向輸送與翻譯后修飾過程同步進行。所有靶向輸送的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中存在分選信號，主要是N末端特異氨基酸序列，可引導蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞的適當靶部位，這類