中國農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目立項(xiàng)申請書

中國友/之母中國農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目立項(xiàng)申請書項(xiàng)目名稱葡萄根癌病高效生防菌JN-74高密度全水溶發(fā)酵工藝研究指導(dǎo)教師@職務(wù)職稱叁授聯(lián)系電話電子信箱..項(xiàng)目名稱葡萄根癌病高效生防菌JN-74高密度全水溶發(fā)酵工藝研究項(xiàng)目名稱項(xiàng)目起止時(shí)間2023年1月-2023年12月一、項(xiàng)目簡介（100字以內(nèi)）本團(tuán)隊(duì)成員前期篩選到一株對葡萄根癌病具有較好生防效果的菌株JN-74{Allorhizobiumvitis}.田間應(yīng)用時(shí)由于培養(yǎng)基中的非可溶原料堵塞滴灌設(shè)備使得菌劑使用受阻，本團(tuán)隊(duì)成員擬解決這一難題，形成有效的菌株JN-74高密度全可溶發(fā)酵方案。二、立項(xiàng)背景（包括國內(nèi)外研究現(xiàn)狀、趨勢、研究意義、參考文獻(xiàn)和其他有關(guān)背景材料）由于生防枯草芽胞桿菌發(fā)酵以活菌為最終發(fā)酵產(chǎn)品，產(chǎn)品附加值較低，因而生產(chǎn)上為了控制成本，培養(yǎng)基原料多采用玉米粉、豆餅粉、花生餅粉等生物質(zhì)材料。導(dǎo)致最終制成的液體固體產(chǎn)品中難溶顆粒物較多，難以適應(yīng)水肥一體化技術(shù)需要。目前生產(chǎn)上各廠家依然采用傳統(tǒng)工業(yè)培養(yǎng)基來進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，待發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液進(jìn)行過濾，過濾掉里面的難溶固體顆粒物，不僅增加了人工成本還造成了染菌的風(fēng)險(xiǎn)。各廠家之所以這樣做主要是因?yàn)槟壳叭馨l(fā)酵配方存在培養(yǎng)基原料成本高，發(fā)酵菌數(shù)低的問題。培養(yǎng)基成本和菌量的不對等，使得全可容培養(yǎng)基的發(fā)酵優(yōu)化工作遇到重重困難。亟需找到制約全可溶培養(yǎng)基菌數(shù)提高的關(guān)鍵影響因素，以推動(dòng)植物微生態(tài)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本項(xiàng)目擬通過發(fā)醉技術(shù)的研究找到高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的全水溶高密度發(fā)酵方案。生防枯草芽胞桿菌高密度發(fā)酵技術(shù)研究的主要內(nèi)容主要有上游的菌種的選育及復(fù)壯、中游的發(fā)酵過程優(yōu)化以及下游的反應(yīng)器設(shè)計(jì)和選擇。目前研究最深入，研究最廣的是發(fā)酵過程的優(yōu)化，也是我重點(diǎn)關(guān)注的高密度發(fā)酵技術(shù)板塊，我國從上世紀(jì)90年代開始出現(xiàn)發(fā)酵過程優(yōu)化相關(guān)的科學(xué)研究⑴。綜合杳閱了網(wǎng)上的文獻(xiàn)資料，發(fā)酵過程優(yōu)化這部分又細(xì)分為四部分的研究內(nèi)容，分別為基于微生物反應(yīng)原理的培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化技術(shù)1221、基于微生物代謝特性的分階段培養(yǎng)技術(shù)⑺、基于發(fā)酵過程動(dòng)力學(xué)模型的優(yōu)化技術(shù)、基于系統(tǒng)學(xué)觀點(diǎn)的優(yōu)化技術(shù)⑻”這其中基于微生物反應(yīng)原理的培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化技術(shù)是文獻(xiàn)資料最廣的，也是研究最深入的。里面主要有培養(yǎng)基的優(yōu)化⑵以及培養(yǎng)條件的優(yōu)化⑶?，F(xiàn)階段優(yōu)化技術(shù)的共性是均是基于微生物表觀特性的優(yōu)化，缺乏微生物內(nèi)部原因的分析，通過菌體生長曲線以及最終的菌量和芽胞量來評(píng)判優(yōu)化舉措的優(yōu)略，而沒有找更深層次的原因。還表現(xiàn)為個(gè)案間差異很大，所用的菌株不一樣，雖然大家都用的生防枯草芽胞桿菌，但是來源不一樣，用的搖瓶不一樣，搖瓶的大小形狀不一樣，因此不具有參考價(jià)值。個(gè)案可以研究非常深入，但共性技術(shù)和規(guī)律性方法的研究、總結(jié)、提煉和借鑒相當(dāng)缺乏，特別是沒有系統(tǒng)總結(jié)過發(fā)酵優(yōu)化的一般原理。面對產(chǎn)業(yè)面臨的實(shí)際問題，回到基礎(chǔ)科學(xué)的研究中去，是解決問題的最優(yōu)策略。針對目前生防菌JN-74發(fā)酵液中顆粒物堵塞滴灌設(shè)備的突出問題，采用基于輔因子鎂離子優(yōu)化技術(shù)探尋高含菌量發(fā)酵方案。本研究的意義不僅在于解決菌株JN-74產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用過程中的痛難點(diǎn)，還可為同類型生防枯草芽胞桿菌高密度發(fā)酵技術(shù)發(fā)展提供參考和借鑒。[1]堵國成，劉立明，李寅，陳堅(jiān).以高產(chǎn)量、高產(chǎn)率、高生產(chǎn)強(qiáng)度為目標(biāo)的發(fā)醉過程優(yōu)化技術(shù)[J].化工進(jìn)展,2006(10):1128-1133.[2]孫文，劉倩倩,胡彥婷，王雅娜,程輝彩，張根偉,張麗萍.響應(yīng)面法優(yōu)化短短芽胞桿菌ch2-22的發(fā)酵工藝[J].微生物學(xué)雜志,2017,37(06):62-69.⑶劉露，李麗，閆洪雪，張鵬鵬,梁文輝，趙宏濤.一株蘋果內(nèi)生枯草芽胞桿菌BS10的發(fā)酵條件優(yōu)化研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2015(23):131-132+139.I41Posada-UribeLF,Romero-TabarezM,Villegas-EscobarV.EffectofmediumcomponentsandcultureconditionsinBacillussubtilisEA-CB0575sporeproduction[J].BioproccssandBiosysteinsEngineering,2015,38(10):1879-1888.15JVYanez-Mendizdbal,ZeriouhH,Vi?AsI,elal.Biologicalcontrolofpeachbrownrot(Moniliniaspp.)byBacillussubtilisCPA-8isbasedonproductionoffengycin-likelipopeptides[J].EuropeanJournalofPlantPathology,2012,132(4):609-619.⑹王慧冬，修建龍,黃立信，俞理，馬原棟.一株采油枯草芽胞桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化[J/OL].應(yīng)用化1:1-912021-10-30].⑺秦為輝，楊帆，吳澤強(qiáng)，等.一種枯草芽胞桿菌的高密度發(fā)酵及噴霧干燥方法:,CNA[P][8]胡治銘，梁從從，國洪旭，等.屎腸球菌和枯草芽胞桿菌混合培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2016,35(005):537-542.⑼劉海明，呂中文.側(cè)抱短芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌混合培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法:,CNB[P].2016.三、特色與創(chuàng)新首先本項(xiàng)目使用的菌株具有鮮明的特色，本項(xiàng)目使用的菌株JW74分離自山東濟(jì)寧患有葡萄根癌病葡萄園健康葡萄樹根際土壤。其防治葡萄根癌病的田間防效高達(dá)80%。本項(xiàng)目使用的培養(yǎng)基具有創(chuàng)新性，目前生防芽胞桿菌發(fā)酵行業(yè)，為了獲得全可溶的發(fā)酵液，普遍采用先發(fā)酵后過濾的方法，雖然節(jié)約了成本，但是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且容易造成發(fā)酵液感染雜菌。本項(xiàng)目擬采用全可溶發(fā)酵配方，在國內(nèi)外鮮有應(yīng)用。本項(xiàng)目開展的工作具有創(chuàng)新性，主要圍繞輔因子鎂離子的用量展開研究，圍繞如何提高芽胞桿菌含菌展的重大課題，不同的團(tuán)隊(duì)有不同的方法，目前未見通過優(yōu)化輔因子鎂來提高發(fā)酵液含菌量的報(bào)道。四、實(shí)施計(jì)劃及方案（包括進(jìn)度安排、研究方案、實(shí)驗(yàn)方案、技術(shù)路線等）1研究方案通過室內(nèi)搖瓶發(fā)醉實(shí)驗(yàn)探究生防菌株JN-74高密度全水溶發(fā)醉可行性。對影響其高密度發(fā)酵培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟進(jìn)行重點(diǎn)關(guān)注，采用全水溶物料組成的培養(yǎng)基配方，對培養(yǎng)基中鎂離子用量進(jìn)行優(yōu)化，使生防菌JN-74發(fā)酵液水平突破100億CFU/mLo2實(shí)驗(yàn)方案菌種保存實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)會(huì)芽胞桿菌菌種保存，整個(gè)項(xiàng)目均使用此次保存的菌種，以確保實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)方法將保存的菌株JN-74在NA固體平板上活化培養(yǎng)。生長24小時(shí)后挑選菌落形態(tài)特征和原始菌株菌落形態(tài)一致的單菌落于另一NA固體平板進(jìn)行劃線培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時(shí)后，涂片觀察，確保視野中的菌體全部產(chǎn)電。未完成產(chǎn)電則繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),直至產(chǎn)抱完全。將平板上的全部菌苔刮下，分裝于2?3支菌種保存管中，后向每只菌種保存管中加入1mL甘油，擰緊蓋子后進(jìn)行震蕩，確保菌苔和甘油溶液混合均勻。最后將保存好的菌種置于-80C冰箱保存。菌種活化實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定合適的單菌落活化時(shí)間，菌種活化培養(yǎng)的時(shí)間對后續(xù)種子培養(yǎng)有重要的影響。通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差顯著性分析。實(shí)驗(yàn)方法從冰箱取出實(shí)驗(yàn)1中保存的JN-74,握在手心利用手心的溫度使其快速融化，使用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液在平板上劃線，后置于微生物培養(yǎng)箱。NA液體培養(yǎng)基的分裝,NA液體培養(yǎng)基配制好后分裝于250mL或者300mL的搖瓶中，每瓶裝夜量為50mL,使用六層紗布覆于瓶口，并在外面覆蓋雙層報(bào)紙（或牛皮紙），后用皮筋扎緊瓶口。于活化培養(yǎng)24h、36h和48h分別挑取四個(gè)單菌落接種于NA液體培養(yǎng)基中，每瓶接種一個(gè)單菌落，培養(yǎng)溫度為37℃,轉(zhuǎn)速為18（）r/min。搖培12小時(shí)后使用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行含菌量的統(tǒng)計(jì)。平板計(jì)數(shù)法的具體操作步驟如下，取1mL菌液于含有9mL無菌水的離心管中，經(jīng)過此步驟對原菌液進(jìn)行了10倍的稀釋，震蕩均勻后從中吸取1mL置于含有9mL無菌水的離心管中，經(jīng)過此步驟進(jìn)一步進(jìn)行了10倍的稀釋，依次逐級(jí)稀釋，一直稀釋1。6倍。之后吸取100ul稀釋液于平板上并使用涂布器涂布均勻，每瓶培養(yǎng)液涂布三個(gè)平板。涂布好之后置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，隔天后進(jìn)行菌數(shù)統(tǒng)計(jì)，并注意觀察菌落大小是否均一，菌落形態(tài)是否?致。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理后選擇各平行間菌數(shù)較穩(wěn)定，且菌落形態(tài)一致的處理組作為候選處理組，這一處理組對應(yīng)的菌種活化時(shí)間就是該菌種的合適活化時(shí)間。種子液培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^實(shí)驗(yàn)2,我們已經(jīng)明確了菌株JN-74合適的活化時(shí)間，接下來就需要進(jìn)行種子液的培養(yǎng)，找到合適的種子液的培養(yǎng)時(shí)間，并確保每次制備的種子液的含菌量都是穩(wěn)定的。本次實(shí)驗(yàn)中需要繪制菌種生長曲線，通過本次實(shí)驗(yàn)還要學(xué)會(huì)折線圖的繪制。實(shí)驗(yàn)方法取一支JN-74菌種保存管，待菌液融化后挑取一環(huán)菌在平板上進(jìn)行活化培養(yǎng)。培養(yǎng)到合適的時(shí)間（實(shí)驗(yàn)2確定）后挑選三個(gè)單菌落分別接菌于3瓶NA液體培養(yǎng)基中，NA液體培養(yǎng)基的配制及分裝以及培養(yǎng)條件同2.3。從接菌后3h起，每隔兩個(gè)小時(shí)取樣?次，使用紫外分光光度計(jì)測量種子液的OD600值。一直統(tǒng)計(jì)到接菌后18h。之后以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，繪制菌株JN-74的種子液生長曲線。在曲線上找到對數(shù)生長末期的種子液培養(yǎng)時(shí)間，這便是菌株JN-74合適的種子液培養(yǎng)時(shí)間。重新進(jìn)行菌種的活化，挑選5個(gè)單菌落接菌于5瓶NA液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，將種子液培養(yǎng)到對數(shù)期末期時(shí)進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)的方法同2.3。井對各平行間菌含量做方差顯著性分析。發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^調(diào)整輔因子鎂離子的用量來實(shí)現(xiàn)菌株JN-74的高密度發(fā)酵培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)方法種子液的制備方法同232。發(fā)酵培養(yǎng)基的制備，將淀粉溶于1L水中后加入培養(yǎng)基配制容器內(nèi)，一邊加熱一邊攪拌，直至淀粉溶液微沸，后將除硫酸鎂的其他物料加入淀粉溶液中，硫酸鎂要在最后單獨(dú)加入，進(jìn)行充分的攪拌，攪拌均勻后調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.0。后將培養(yǎng)基分裝于各三刺搖瓶中，搖瓶體積為500mL,培養(yǎng)基的裝液后為75mL,之后將稱最好的硫酸鎂加入各發(fā)酵瓶。稱量的時(shí)候要注意，小于1g的物品要使用分析天平稱量。發(fā)酵瓶II覆六層紗布，紗布外面覆兩層保質(zhì)，因?yàn)榘l(fā)酵培養(yǎng)基中含有葡萄糖，因此滅菌溫度不能太高，U5C30min即可。硫酸鎂添加量的設(shè)置，硫酸鎂的添加量分別為lg/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L五個(gè)梯度。種子液制備好后，以10%（V/V）的接種最將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，種子液接種后記得同時(shí)要進(jìn)行種子液的平板計(jì)數(shù)，以便在發(fā)醉不穩(wěn)定的時(shí)候?qū)ふ以?。發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為34C,轉(zhuǎn)速為180r/min。發(fā)酵24h進(jìn)行涂片觀察，待視野中的芽泡率超多90%時(shí)即可結(jié)束發(fā)酵，計(jì)下整個(gè)發(fā)酵周期，此為發(fā)酵周期，發(fā)酵24小時(shí)若沒有完成發(fā)酵，則在之后，每隔兩個(gè)小時(shí)，觀察一次，直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后通過平板計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)發(fā)酵液中的含菌量。之后對本批實(shí)驗(yàn)不同硫酸鎂含量發(fā)酵液的含菌量進(jìn)行方差顯著性分析，并進(jìn)行多個(gè)批次的重復(fù)，選擇一個(gè)發(fā)酵含菌量最高的硫酸鎂添加量。3技術(shù)路線

葡萄根癌病高效牛.防菌JN-74高密度全水溶發(fā)酵工藝研究完成的種JN-74的穩(wěn)定保存—生防菌JN-74的種保存O生防的JN-74的種活化—確定菌株JN74的合適時(shí)間O探究合適的種子液制德方案—生防茵JN-74種子液制品生防茵JN-74發(fā)酵培笄—確定全可溶培養(yǎng)基中合適的硫酸鎂用量確定生防菌JX-74的高密度全水溶發(fā)酵方案4進(jìn)度安排計(jì)劃用時(shí)項(xiàng)目進(jìn)展2023年春季開學(xué)項(xiàng)目開始一周完成生防菌JN-74菌種保存工作兩周確定菌株JN-74的菌種活化時(shí)間兩個(gè)月明確菌株JN-74的合適的種子液制備方案2023年暑假之前完成以上工作，并準(zhǔn)備中期考核資料三個(gè)月全可溶培養(yǎng)基中合適硫酸鎂用量的探究一個(gè)月整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，查漏補(bǔ)缺2023年寒假前，取得預(yù)期實(shí)驗(yàn)成果并撰寫項(xiàng)目結(jié)題報(bào)告五、實(shí)施基礎(chǔ)和條件本項(xiàng)目將由四名同學(xué)共同完成，一名博士生，一名研究生，兩名本科生，由博士生帶隊(duì)，負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的規(guī)劃和設(shè)計(jì)，研究生和本科生共同擔(dān)負(fù)起實(shí)驗(yàn)方案的實(shí)施和修正。實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)在芽胞桿菌全水溶高密度發(fā)酵研究方面取得一定的成果并積累了豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，菌株JN-74經(jīng)鑒定為解淀粉芽胞桿菌，是枯草芽抱桿菌家族成員，為本實(shí)驗(yàn)室的主要研究對象，因此有充分的理論基礎(chǔ)確保項(xiàng)目的順利推進(jìn)。本實(shí)驗(yàn)室配備有紫外分光光度計(jì)、微生物培養(yǎng)箱，搖床等項(xiàng)目開展所需的各類儀器和設(shè)備，可保證項(xiàng)目的順利開展。六、預(yù)期成果形成一套葡萄根癌病高效生防菌JN-74高密度全水溶發(fā)酵方案，并完成發(fā)酵罐小試實(shí)驗(yàn)，預(yù)期最終發(fā)酵液含菌量達(dá)到100億CFU/mL。

七、經(jīng)費(fèi)預(yù)算（儀器、材料、藥品名稱；單價(jià)；數(shù)量）名稱規(guī)格單