第六章基因表達調(diào)控(二)

人工基因組的設計與合成李炳志bzli@2013-031中心法則蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復制DNARNA復制2溫故知新Lac操縱子Trp操縱子3第六章

基因表達調(diào)控(二)李炳志bzli@2013-034第六章基因表達調(diào)控基本概念原核表達調(diào)控真核表達調(diào)控5根據(jù)其性質(zhì)可分為兩大類：一是瞬時調(diào)控或稱為可逆性調(diào)控，它相當于原核細胞對環(huán)境條件變化所做出的反應。瞬時調(diào)控包括某種底物或激素水平升降時，及細胞周期不同階段中酶活性和濃度的調(diào)節(jié)。二是發(fā)育調(diào)控或稱不可逆調(diào)控，是真核基因調(diào)控的精髓部分，它決定了真核細胞生長、分化、發(fā)育的全部進程。真核生物基因表達調(diào)控的種類6真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點（1）基因組大，基因多，存在大量重復序列，大部分與組蛋白和非組蛋白結(jié)合在一起；（2）基因主要以單順反子形式存在；（3）多數(shù)基因是斷裂的；（4）存在基因家族；（5）基因表達的調(diào)控位點多，位置多樣化；（6）部分基因組序列存在重排、擴增、丟失等規(guī)律性變化。7真核基因表達調(diào)控的層次8真核生物基因表達調(diào)控的層次1、DNA水平調(diào)節(jié)2、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)3、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)4、翻譯水平調(diào)節(jié)5、翻譯后加工的調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物RNAmRNA蛋白質(zhì)前體mRNA降解物活性蛋白質(zhì)DNA水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)翻譯調(diào)節(jié)mRNA降解的調(diào)節(jié)翻譯后加工的調(diào)節(jié)核細胞質(zhì)9

真核生物DNA水平上的基因表達調(diào)控●基因丟失基因擴增基因重排DNA甲基化狀態(tài)染色體結(jié)構(gòu)●●●●10基因丟失：在細胞分化過程中，可以通過丟失掉某些基因而去除這些基因的活性。某些原生動物、線蟲、昆蟲和甲殼類動物在個體發(fā)育中，許多體細胞常常丟失掉整條或部分的染色體，只有將來分化產(chǎn)生生殖細胞的那些細胞一直保留著整套的染色體。目前，在高等真核生物（包括動物、植物）中尚未發(fā)現(xiàn)類似的基因丟失現(xiàn)象。細胞全能性：在多細胞生物中每個體細胞的細胞核具有個體發(fā)育的全部基因，只要條件許可，都可發(fā)育成完整的個體。11出生日期：1996年7月5日出生地點：英國愛丁堡市羅斯林研究所死亡日期：2003年2月14日死亡原因：被確診患進行性肺病后處以安樂死創(chuàng)造者：伊恩·維爾穆特及其領(lǐng)導的小組基因父親：無基因母親：一只芬蘭多塞特白面綿羊線粒體母親：一只蘇格蘭黑臉羊生育母親：另一只蘇格蘭黑臉羊子女：生育6名，存活5名12基因擴增：基因擴增是指某些基因的拷貝數(shù)專一性增大的現(xiàn)象，它使得細胞在短期內(nèi)產(chǎn)生大量的基因產(chǎn)物以滿足生長發(fā)育的需要，是基因活性調(diào)控的一種方式。如果蠅的不切離多次復制導致的基因擴增現(xiàn)象。13基因組拷貝數(shù)增加，即多倍性，在植物中是非常普遍的現(xiàn)象?；蚪M拷貝數(shù)增加使可供遺傳重組的物質(zhì)增多，這可能構(gòu)成了加速基因進化、基因組重組和最終物種形成的一種方式。發(fā)育或系統(tǒng)發(fā)生中的倍性增加在植物中普遍存在14多倍體的DNA含量與組織的成熟程度成正比。對于一給定的物種，C是單倍體基因組中的DNA質(zhì)量。15將一個基因從遠離啟動子的地方移到距它很近的位點從而啟動轉(zhuǎn)錄，這種方式被稱為基因重排。通過基因重排調(diào)節(jié)基因活性的典型例子是免疫球蛋白結(jié)構(gòu)基因的表達。基因重排：161718DNA的甲基化狀態(tài)：19甲基化酶:1、維持性甲基化酶(日常型甲基化酶)：在DNA復制時,可識別新合成的半甲基化雙鏈,并將甲基加到新鏈的非甲基化胞嘧啶上;2、從頭合成型甲基化酶：不需要甲基化的DNA模板作指導,可以直接使非甲基化的DNA甲基化20原核細胞的DNA甲基化1、限制修飾系統(tǒng)的甲基化（1）限制外源DNA：

限制性內(nèi)切酶切斷外源DNA（保護機制）（2）保護自身DNA：通過內(nèi)切酶識別位點特定堿基的甲基化保護自身DNA212、Dam甲基化（1）DNA腺嘌呤甲基化酶：識別序列GATC（2）作用：

a、錯配修復：識別母鏈，修正子鏈

b、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)：如抑制轉(zhuǎn)座酶基因的轉(zhuǎn)錄，抑制轉(zhuǎn)座22真核細胞DNA甲基化1、甲基化部位：胞嘧啶（C）5-甲基胞嘧啶（5-mC）（1）脊椎動物：5’-CG-3’

（2）植物（兩種基序）：5’-CG-3’，5’-CNG-3’23（3）CpG島：富含CpG的一段DNA，一般位于基因啟動子附近特點：

a、1~2kb；

b、位于基因5’端；

c、富含CpG二核苷酸基序24在真核生物中，5-甲基胞嘧啶主要出現(xiàn)在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中CpG二核苷酸通常成串出現(xiàn)在DNA上，稱為CpG島252、甲基化的作用：（1）基因表達調(diào)控的一種方式（2）抑制外源基因的表達（3）抑制轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)座子的活動263、DNA甲基化與基因表達調(diào)控

基因表達與甲基化呈負相關(guān)

DNA甲基化轉(zhuǎn)錄抑制作用機理（1）識別位點中胞嘧啶被甲基化，轉(zhuǎn)錄因子不能與其結(jié)合（2）特異性識別甲基化DNA的蛋白（如MeCP1）競爭性地抑制了轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合（3）DNA甲基化導致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA構(gòu)象的改變274、DNA甲基化與基因組印跡

（1）基因組印跡：來源于父母本的一對等位基因表達不同（如X染色體失活）（2）基因組印跡的機制--DNA高度甲基化28染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄常染色質(zhì)（euchromatin）---基因可以轉(zhuǎn)錄，也稱活性染色質(zhì)異染色質(zhì)（hetrochromatin）---基因不能轉(zhuǎn)錄

活性基因置于異染色質(zhì)內(nèi)會失活位置效應（Positioneffect）：指基因轉(zhuǎn)移到基因組上新位置而引起基因表達的改變29異染色質(zhì)化：基因組某些區(qū)域被組裝成高度壓縮的異染色質(zhì)的過程巴氏小體：哺乳類雌體細胞1條X染色體異染色質(zhì)化（雌性X染色體基因表達的蛋白質(zhì)可能是雄性的兩倍）劑量補償：女性兩條X染色體的作用與男性一條X染色體基因產(chǎn)物劑量平衡的現(xiàn)象30活性染色質(zhì)的主要特點在結(jié)構(gòu)上：活性染色質(zhì)上具有DNaseI超敏感位點活性染色質(zhì)上具有基因座控制區(qū)活性染色質(zhì)上具有核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（MAR序列）31活性染色質(zhì)上具有DNaseI超敏感位點。每個活躍表達的基因都有一個或幾個超敏感位點，大部分位于基因5′端啟動子區(qū)域。32活性染色質(zhì)上具有核基質(zhì)結(jié)合區(qū)（matrixattachmentregion，MAR）。MAR一般位于DNA放射環(huán)或活性轉(zhuǎn)錄基因的兩端。DNA放射環(huán)：由直徑為25～30nm的DNA纖絲放射狀折疊排列成約250nm左右的染色單體絲。在外源基因兩端接上MAR，可增加基因表達水平10倍以上，說明MAR在基因表達調(diào)控中有作用。是一種新的基因調(diào)控元件。3334真核轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控順式調(diào)控元件(cis-regulatingelement)

啟動子、增強子、沉寂子、絕緣子、減弱子、應答元件反式作用因子(trans-actingfactor)

是通過識別和結(jié)合順式調(diào)控元件的核心序列而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的一組蛋白質(zhì)．

35反式作用元件的結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域連接區(qū)36

轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合域幾種常見基序

鋅指(zincfinger)

螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix)二聚體結(jié)構(gòu)域：

螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix，HLH)

亮氨酸拉鏈(Leucinezipper) 37鋅指(zincfinger) C2H2型：由肽鏈的保守序列中的一對組氨酸和一對半胱氨酸(His2／Cys2)與鋅離子形成一個四面體結(jié)構(gòu)有兩條β鏈和一個α螺旋，α螺旋區(qū)域上含有保守的堿性氨基酸，負責與DNA結(jié)合如TFIIIA、與GC盒結(jié)合的SPlC2H2型38C4型：

2對半胱氨酸(cys2／cys2)與一個鋅離子形成配位鍵，如類固醇激素受體家族

3940螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix)

兩段螺旋被一短的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)分開多種果蠅胚胎發(fā)生的調(diào)節(jié)蛋白，同源異型蛋白

13241亮氨酸拉鏈(Leucinezipper)由一段每7個氨基酸殘基就有一個Leu的伸展肽鏈組成，這些周期性出現(xiàn)的Leu都位于α-螺旋的同一側(cè)面，形成一個疏水的表面，因此兩條均含Leu拉鏈基序的蛋白質(zhì)通過亮氨酸側(cè)鏈的疏水作用形成二聚體。

LLLLLLLL++++++++

NH2NH2COOHCOOH肽鏈氨基端富含堿性氨基酸殘基區(qū)，可與DNA結(jié)合。42堿性結(jié)構(gòu)域富含堿性氨基酸殘基在許多DNA結(jié)合蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)通常與其他的二聚體結(jié)構(gòu)域如亮氨酸拉鏈或HLH基序中的一個聯(lián)合在一起，結(jié)果被稱為堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）或堿性HLH（bHLH）蛋白。蛋白質(zhì)二聚體使兩個堿性結(jié)構(gòu)域相鄰進而可與DNA發(fā)生作用。43N-端堿性結(jié)構(gòu)域形成一個對稱結(jié)構(gòu)，象一個夾子夾在DNA上44

++

++

++螺旋-環(huán)-螺旋(Helix-loop-Helix)

HLH由2個α螺旋間隔一個非螺旋的環(huán)(loop)組成，通過C端α螺旋的疏水作用形成二聚體堿性結(jié)構(gòu)域堿性HLH蛋白與堿性亮氨酸拉鏈這種異二聚體的形成增加了轉(zhuǎn)錄因子的多樣性和復雜性NH2NH2COOHCOOH45轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域

是反式作用因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域，一般由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域外的30-100個氨基酸組成1．酸性結(jié)構(gòu)域也叫做“酸斑（acidblobs）”或“帶負電的長鏈（negativenoodles）”富含酸性氨基酸存在于許多轉(zhuǎn)錄因子的激活結(jié)構(gòu)域中，如：yeastGcn4andGal4,

哺乳動物的糖皮質(zhì)激素受體的兩個激活結(jié)構(gòu)域462．富含谷氨酰胺激活結(jié)構(gòu)域：

富含谷氨酰胺

（SP1，OCT－1，OCT

－2，SRF等）

3．富含脯氨酸激活結(jié)構(gòu)域

富含脯氨酸有一個能激活轉(zhuǎn)錄的連續(xù)脯氨酸殘基鏈

（AP－2、Jun、SRF

等）474、轉(zhuǎn)錄因子的活化途徑：（1）需要時蛋白被合成，但很快被降解，不能積累。（2）通過與配體結(jié)合被活化。（3）通過磷酸化被活化。（4）結(jié)合DNA亞基的加入，與帶有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)形成復合物。（5）通過抑制因子的磷酸化，暴露隱蔽的活化區(qū)域。（6）通過去除一個抑制蛋白，刺激轉(zhuǎn)錄因子入核。48真核轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可變剪切反式剪切49mRNA前體的可變剪接mRNA前體通過不同方式的剪接，可由一個基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生出不同的成熟mRNA，從而翻譯出不同的蛋白質(zhì)的過程稱為可變剪接（alternativesplicing）或選擇性剪接。來自一個基因的mRNA前體因可變剪接產(chǎn)生多種成熟mRNA，翻譯出不同的蛋白質(zhì)，或形成一組相似的蛋白質(zhì)家族，都可稱為同工型蛋白質(zhì)（isoform）。5051順式剪接剪接過程一般發(fā)生同一個RNA分子的內(nèi)部，即通過剪接將一個RNA分子內(nèi)的內(nèi)含子剪掉，使外顯子連接在一起，這種剪接方式稱為順式剪接（cis-splicing）。52兩種不同來源的RNA前體分子的內(nèi)含子之間具有互補序列時，發(fā)生反式剪接（trans-splicing）。反式剪接53翻譯水平調(diào)控翻譯水平的調(diào)控是真核生物基因表達多級調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一。真核生物翻譯水平調(diào)控最普遍的機制是起始因子的磷酸化。mRNA結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性與翻譯控制掩蔽mRNA（maskmRNA）：蛋白質(zhì)結(jié)合到mRNA上并阻止翻譯。54uORF調(diào)控翻譯過程uORF：上游開放讀碼框。酵母GCN4基因的mRNA的翻譯收到四個uORF的調(diào)控。55基因沉默基因沉默（genesilencing）：指生物體中特定基因由于種種原因不能表達或表達量很低的遺傳現(xiàn)象。轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(TGS)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(PTGS)DNAmRNAProteinDNAmRNAProtein56是由dsRNA介導的，通過目標mRNA的降解而使特定基因沉默的現(xiàn)象。

RNA沉默DNAmRNAProteinRNA