從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)方案

從土壤中分別產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌試驗(yàn)方案TheStandardizationOfficewasrevisedontheafternoonofDecember13,2023土壤中產(chǎn)淀粉酶芽胞桿菌的篩選及其淀粉酶活力的測(cè)定設(shè)計(jì)性試驗(yàn)方案一、綜述：淀粉酶是淀粉降解酶。它們廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物體中。它們將淀粉及相關(guān)的聚合物分解為帶有具體淀粉分解酶特征的產(chǎn)品。淀粉酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中,是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類繁多,特點(diǎn)各異,可應(yīng)用于造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑]等多種領(lǐng)域。在釀造發(fā)酵工業(yè)如酒精生產(chǎn)、啤酒制造、發(fā)酵原料液化及糖化工藝過程中均有重要價(jià)值,如添加淀粉酶分布格外廣泛，是人們常常爭(zhēng)論的一種酶。從紡織工業(yè)到廢水處理，這些酶都有不同規(guī)模的應(yīng)用【1】。常見產(chǎn)淀粉酶的主要為芽孢桿菌屬。其中的常見產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌菌種有：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌【2】、分散芽孢【3】。由于芽孢桿菌屬是一類好氧或兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生抱子的桿狀細(xì)菌，很多為腐生菌，主要分布于土壤和植物體外表及水體中【4】。所以此次實(shí)驗(yàn)從土壤中分別產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。二、試驗(yàn)?zāi)康囊蠖?、試?yàn)?zāi)康囊罅私馍锓謩e提純的原理和方法技術(shù)把握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理和方法把握微生物搖瓶培育方法及淀粉酶活力測(cè)定的原理和方法培育學(xué)生的綜合應(yīng)用微生物試驗(yàn)方法的力量培育學(xué)生自行設(shè)計(jì)試驗(yàn)流程、綜合分析問題解決問題和推斷試驗(yàn)結(jié)果的力量。三、試驗(yàn)原理和生命活動(dòng)中所需的各種條件。般地說，在土壤外表，由于日光照耀及枯燥等因素的影響，微生物不易生存，【5】。分別與純化。平板分別法普遍用于微生物的分別與純化。其根本原理是選擇適合與待分別微生物的生長(zhǎng)條件，如養(yǎng)分成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或參加某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分別生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不肯定保證是純培育。因此，純培育確實(shí)定除觀看其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培育要經(jīng)過一系列分別與純化過程和多種特征鑒定才能得到。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分別生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不肯定保證是純培育。因此，純培育確實(shí)定除觀看其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培育要經(jīng)過一系列分別與純化過程和多種特征鑒定才能得到。芽孢桿菌屬的共同特征是：革蘭氏陽性；接觸酶陽性；水解淀粉；VP試驗(yàn)陽性；不產(chǎn)生吲哚；苯甲氨酸不脫氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不產(chǎn)生二羥丙酮；養(yǎng)分體的最高生長(zhǎng)溫度大約從25℃到75℃以上；最低生長(zhǎng)溫度大約5℃到45℃；生長(zhǎng)最低pH值，從—822%NaCl25%NaCl；養(yǎng)清楚膠〔22℃〕71厘米或1厘米以上。枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌在糖發(fā)酵試驗(yàn)用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可產(chǎn)酸；作為養(yǎng)分生長(zhǎng)的最低限培育基是無維生素的，但含有葡萄糖、檸檬酸鹽和一個(gè)氨態(tài)鹽作為唯一的碳源和氮源【6】。細(xì)菌特性生殖快速:106倍。:無濕狀態(tài)可耐低溫-60℃、耐高溫+280℃，耐強(qiáng)酸、耐強(qiáng)堿、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧生殖)、耐低氧(厭氧生殖)。體積大:體積比一般病源菌分子大四倍數(shù)，占據(jù)空間優(yōu)勢(shì)，抑制有害菌的生長(zhǎng)生殖。四、試驗(yàn)材料和用具土樣采集土樣采集：采集寬闊植物園內(nèi)的有機(jī)土壤，和生化樓下花壇的有機(jī)土壤養(yǎng)分瓊脂(%)1牛肉膏氯化鈉瓊脂～蒸餾水15%2mL，校正pH至～。參加瓊脂,加熱煮沸，使瓊脂溶化。淀粉牛肉膏蛋白胨培育基(%)：可溶性淀粉牛肉蛋白氯化鈉瓊脂～pH至～發(fā)酵培育基(%)：玉米粉2 黃豆餅粉CaCl MgSO4 NaClK2HPO4檸檬酸鈉硫酸氨(溶解后加) 校正pH值葡萄糖蛋白胨培育基〔試驗(yàn)用〕〔%〕：葡萄糖蛋白胨K2HPO4 校正pH～蛋白胨水培育基〔吲哚試驗(yàn)用〕〔%〕：1%氯化鈉%校正pH～西蒙氏檸檬酸鹽培育基〔%〕：氯化鈉硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 氫銨磷酸氫二鉀檸檬酸瓊脂2溴麝香草酚藍(lán)溶液4酚紅試劑校正pH，再參加瓊脂，加熱溶化，然后參加指示劑，混勻后分裝試管，12115min。配制養(yǎng)清楚膠培育基〔%〕pH~耐鹽培育基〔%〕：1牛肉膏2～蒸餾水1牛肉膏10～蒸餾水1牛肉膏20～蒸餾水1牛肉膏25～蒸餾水15%2mL，校正pH至～。參加瓊脂,加熱煮沸，使瓊脂溶化。溶液或試劑染料革蘭氏染色：草酸銨結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇;芽孢染色：5%孔雀綠溶液,石炭酸復(fù)紅液;香柏油、二甲苯吲哚試驗(yàn)：乙醚、吲哚試劑.試驗(yàn)：40％NaOH溶液、α-奈酚，淀粉酶活力測(cè)定：1%3,5-二硝基水楊酸試劑儀器或其它用具無菌玻璃涂棒無菌吸管接種環(huán)無菌培育皿土樣三角瓶燒杯洗瓶五、試驗(yàn)方法及步驟1、初篩方法1、初篩方法①制菌懸液5g45mL無菌水的三角瓶，振蕩10min,10-112個(gè)，4AB。②加熱篩選有芽孢的菌2個(gè)錐形瓶加塞、包扎、搖勻〔無菌室里〕，利用10015min〔制懸液時(shí)就應(yīng)先開頭加熱〕，10-1g/ml的土壤懸液③梯度稀釋菌懸液：再分別另取裝有9mL無菌水試管5支，用記號(hào)筆編上10-2、10-3、10-4、10-5。取已稀釋成10-1土壤液，振蕩后靜止，用無菌的移液器吸取1mL土壤懸液參加10-2的無菌水的試管中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成10-2土壤稀釋液。同法從10-2的試管中吸取1mL稀釋液參加編號(hào)為10-3的無菌水試管中，混勻后即為10-3土壤稀釋液，依次連續(xù)稀釋為10-4、10-5土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中，用一樣的移液槍頭由濃到稀來稀釋。④涂布平板用一支的無菌槍頭，由低濃度開頭，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對(duì)號(hào)較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨培育基平板上，用灼燒冷卻后的無菌玻璃涂棒涂勻。每個(gè)濃度做3個(gè)平板〔重復(fù)〕。37℃下恒溫培育24h。2、復(fù)篩方法劃線接種〔分區(qū)劃線法〕：在上述不同稀釋度培育基中挑取不2、復(fù)篩方法劃線接種〔分區(qū)劃線法〕：在上述不同稀釋度培育基中挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)展分區(qū)劃線，先在平板培育基的一邊作第1次平行劃線3~4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培育皿約60°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第1次劃線局部作第2次平行劃通過第3次平行劃線局部作第4次平行劃線〔如右圖〕。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于28~29°C溫室中培育約20h.。再連續(xù)分區(qū)劃線2-3次，以獲得較純的菌種。菌種，另一局部用來做染色試驗(yàn)。3、獲得產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌純種：上述劃線接種后的菌落中各挑取形態(tài)特征不全都的點(diǎn)接于倒好的淀粉牛肉膏培育基85個(gè)區(qū)3724h。室，其他置于無菌室。試驗(yàn)室里，四個(gè)平板均參加碘液，馬上觀看記錄陽性和陰性菌落所在位置，并可同時(shí)記錄透亮圈的大小。依據(jù)所記錄的陽性菌的編號(hào)，利用另一組中的養(yǎng)分瓊脂平板上其對(duì)應(yīng)的菌落連續(xù)劃線接種，培育后將消滅的形態(tài)特征不全都的菌落進(jìn)展編號(hào)，然后挑取局部出來進(jìn)展革蘭氏染色鏡檢，假設(shè)覺察視野內(nèi)消滅形態(tài)、大小、顏色全都且為桿菌的菌體，則將其對(duì)應(yīng)的菌種劃線接種到的養(yǎng)分瓊脂平板上，標(biāo)記，3724h。否則連續(xù)進(jìn)展劃線分別，培育后再經(jīng)革蘭氏染色鏡檢直至得到純種桿菌后進(jìn)展芽孢染色。篩選出芽孢純種后進(jìn)展斜面接種。革蘭氏染色步驟：涂片、枯燥及固定1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。1分鐘，后水洗。脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)展脫色約15－20秒，后馬上用流水沖洗。3－5分鐘，水洗后用吸水紙吸干。鏡檢：油鏡觀看染色結(jié)果。：·取37℃培育18～24h的枯草芽孢桿菌涂片，枯燥，固定。·于涂片上滴人3～55%孔雀綠水溶液。4～5min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時(shí)可添加少許染料?！A去染液，待玻片冷卻后，水沖洗至孔雀綠不再褪色為止?！min，水洗?！ぶ破菰锖笥糜顽R觀看。芽孢呈綠色，菌體紅色?！沧ⅲ河^看芽孢的外形和位置，查伯杰細(xì)菌手冊(cè)〕斜面保存菌種·貼標(biāo)簽取各種無菌斜面試管數(shù)支，將注有菌株名稱和接種日期的標(biāo)簽貼上，貼在試管斜面的正上方，距試管口2～3cm處。〔每種菌接3管，標(biāo)上一樣編號(hào)也要與平板上菌落編號(hào)相對(duì)應(yīng)〕。進(jìn)展斜面接種操作，加塞、包扎好到37℃培育箱里培育24h。5、菌種的鑒定的大小、顏色、干濕狀況、形態(tài)、高度、透亮程度、邊緣、是否易被挑起、〔具體步驟同上〕觀看是否符合附表中芽孢桿菌的指標(biāo)生理生化試驗(yàn)溫度對(duì)菌種培育的影響；淀粉水解試驗(yàn)；溫度對(duì)菌種的影響；明膠液化試驗(yàn)；糖發(fā)酵試驗(yàn)；乙酰甲基甲醇試驗(yàn)試驗(yàn))；吲哚試驗(yàn)；耐鹽性試驗(yàn)；檸檬酸鹽利用試驗(yàn)?！囟葘?duì)微生物生長(zhǎng)的影響將牛肉膏蛋白胨培育基熔化倒平板?！?倍〕取30套牛肉膏蛋白胨平板，分別進(jìn)展標(biāo)號(hào)。 板中分別劃線接種不同的菌種，每個(gè)菌種重復(fù)接種六個(gè)平板。各取每個(gè)菌種兩套平板倒置于4℃〔冰箱〕、37℃〔或者室溫〕，60℃下保溫培育24小時(shí)，觀看細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況?！病啊辈簧L(zhǎng)，“+”生長(zhǎng)較差，“++”生長(zhǎng)一般，“+++”生長(zhǎng)良好?！さ矸鬯庠囼?yàn)以18-24h的純培育物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板〔一個(gè)平板可分區(qū)劃“+“字接種，〕或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1℃培育24-48h，或于20℃培育5天。然后將碘試劑直接滴浸于培育外表，假設(shè)為液體培育物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。馬上檢視結(jié)果，陽性反響〔淀粉被分解〕為瓊脂培育基呈深藍(lán)色、菌落或培育物四周消滅無色透亮環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反響則無透亮環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐步進(jìn)展的過程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的力量、培育時(shí)間，培育基含有淀粉量和pH等均有肯定關(guān)系。培育基pH必需為中性或微酸性，以最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時(shí)制備為妥?！ぬ穷惏l(fā)酵試驗(yàn)〔葡萄糖、木糖和乳糖發(fā)酵〕名稱。用接種針將各種桿菌分別接種于兩種發(fā)酵管內(nèi)，每種發(fā)酵管重復(fù)兩次，標(biāo)記，要與斜面菌種標(biāo)記相對(duì)應(yīng)。兩種發(fā)酵管各設(shè)一支不接種，作為空白對(duì)小燒杯內(nèi)，3724h。觀看記錄：與比照管比較，假設(shè)接種培育液保持原有顏色，其反響結(jié)果為陰性，說明該菌不能利用該種糖，記錄用“－”表示；如培育液呈黃色，反響結(jié)果為陽性，說明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“＋”表示。培育液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反響，說明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“＋”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反響，記錄用“－”?！ひ阴＜谆状荚囼?yàn)(V．P試驗(yàn))接種培育3724h。觀看記錄取出以上試管，充分振蕩2min。每管分別參加40％NaOH溶液10～20滴，并加等量α-奈酚，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37℃恒溫箱中保溫15～30min后，假設(shè)培育液呈紅色，記錄為.試驗(yàn)陽性反響〔用“＋”表示〕；假設(shè)不呈紅色，記錄為.試驗(yàn)陰性反響〔用“－”表示〕?！み胚嵩囼?yàn)試管標(biāo)記接種培育3724h。觀看記錄在培育液中參加乙醚1～2ml，經(jīng)充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置5～10滴吲哚試劑〕，如有吲陽性用“＋”、陰性用“－”表示?！つ望}性試驗(yàn)將分別獲得的細(xì)菌分別接種在NaCl濃度為2%，10%，20%，25%，的牛·檸檬酸鹽試驗(yàn)37℃恒溫箱中24h。觀看結(jié)果，假設(shè)培育基變藍(lán)色，則說明該菌能利用檸檬酸鹽作為碳源而生長(zhǎng)，即為陽性反響，以“＋”表示。假設(shè)培育基仍為綠色則為陰性反響，以“－”表示【8】。6、產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶活性的測(cè)定發(fā)酵：將初篩純菌種接種于30/250mL種子培育基,37℃、250r/min搖床培育過夜。種子液以2%接種量接種于產(chǎn)酶液體培育基50/500mL,一樣條件培養(yǎng)72h,發(fā)酵8000r/min，離心10min,取上清液測(cè)酶活,每個(gè)樣品重復(fù)3次,最終結(jié)果取平均值。在Young等方法的根底上作了改進(jìn)：取5ml%的可溶性淀粉溶液，在40℃水浴中預(yù)熱10min，然后加適當(dāng)稀釋的酶液，反響5min后，用5mlLH2SO4終止反響。取反響液與5ml碘液顯色，在620nm處測(cè)光密度。以水代替反響液為空白，以不加酶液〔加同樣體積的緩沖液〕的管為比照。酶活力依據(jù)下式計(jì)算：酶活力〔u/ml〕=(R-r)/R*50*D式中R、r分別表示比照和反響液的光密度，D為酶的稀釋倍數(shù)。調(diào)整D使〔R-r〕/R在之間。確定在40℃5min內(nèi)水解1m