分子生物學實驗報告

分子生物學試驗報告Revisedasof23November2023分子生物學試驗命科學與技術學院專業(yè)：生物科學〔基地〕班級： 202301班分子生物學根底試驗分子生物學試驗技術已成為生物化學及分子生物學以及相關學科院系教學科研不行DNA的重組；PCR基因擴增等等。試驗一質粒DNA的小量制備一、試驗原理運載工具，攜帶外源基因進入受體細胞的這種工具就叫載體〔vector〕。載體的設:(1)體細胞中能大量增殖，只有高復制率才能使外源基因在受體細胞中大量擴增；〕入；〕載體具有選擇性的遺傳標記，如有抗四環(huán)素基因〕，抗霉素基因細胞中分別篩選出來。細菌質粒具備上述條件，它是基因工程中常用的載體之一。具有雙鏈閉合環(huán)狀構造的DNA分子，主要覺察于細菌、放線菌和真菌細胞中。質粒就不能存活，而它掌握的很多生物學功能也是對宿主細胞的補償。1個或幾個質粒分子。后者的質粒在質粒如F因子等，拷貝數(shù)較少，復制受到嚴格掌握。小的質粒，如ColEⅠ質?！埠挟a生大腸桿菌素E1基因〕，拷貝數(shù)較多，復制不受嚴格掌握。在使用蛋白質合成抑制劑－氯霉素時，染色體DNA復制受阻，而松弛型ColEⅠ質粒連續(xù)復制12－16h20多個拷貝可擴增至1000－3000個拷貝，此時質粒DNA占總DNA的含量由原來的240％－50％。本試驗分別提純化的質粒:培育細菌使質粒擴增；收集和裂解細菌；分別和純化質粒DNA。承受溶菌酶可破壞菌體細胞壁，十二烷基硫酸鈉〔SDS〕可使細胞壁解，經溶菌酶和陰離子去污劑〔SDS〕處理后，細菌染色體中。用乙醇沉淀、洗滌，可得到質粒DNA。DNA的相對分子量一般在106－107范圍內，如質粒pBR322的相對分子cccDNA形式存在，它比其開環(huán)和線狀DNA的泳動速度快，因此在本試驗中，自DNA在電泳凝膠中呈現(xiàn)3條區(qū)帶。二、試驗目的把握最常用的提取質粒DNA的方法和檢測方法。了解制備原理及各種試劑的作用。三、試驗材料和試劑材料：大腸桿菌，含pBR322質粒。試劑：pH至左右。如固體培育基則添加15g/L瓊脂。EDTA。滅菌后存放。LTris-HCl抽提幾次以平衡這一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面掩蓋等體積的mol/LTris-HCl，4℃保存。無水乙醇7.70％乙醇.20μg/mL。儀器：四、操作步驟〔一〕培育細菌50μg/mL氨芐青霉素(Amp)的LBAmpLB培育基冷卻到50℃左右方可參加?！捕硰木渲锌焖偬崛≈苽滟|粒DNA棄上清，參加150μLGET緩沖液，在渦旋混合器上充分混勻，在室溫下放置10min。配制的L〔不要振蕩次，使之混勻，冰上放置4min，最多不能超過5min。15min。離心一次。用()，備用。保存，供下午電泳使用。泳，下面為瓊脂糖凝膠電泳的原理及方法：EBDNA分子后在紫外下顯熒光。而熒光強度正比于DNA的含量，如將濃度的標準樣品表2－1照，只需要5－10ngDNA，就可以從照片上比較鑒別。工程中常常被用做檢測DNA樣品。片段 堿基對數(shù)目/kb 相對分子質量含量/(ng/mg)1×1062×1063×1064×10695×1066×1067×10688×106瓊脂糖凝膠板的制備1．瓊脂糖凝膠的制備稱取瓊脂糖，置于錐形瓶中，參加100mLTBE緩沖液，于電爐上加熱，注使其終濃度為1％。膠板的制備個邊腳模子。留意：將橡皮膏緊貼在有機玻璃內槽兩端邊上，不能留空隙。65℃左右的瓊脂糖凝膠，留神地倒在內槽上，掌握灌膠速度，使膠液緩慢地開放，輕拔出樣品槽模板，撕去膠帶紙，膠板上即形成相互隔開的樣品槽?！罷BE電泳緩沖液，以蓋過膠板為宜。膠板內的樣品小槽加樣用移液槍將上述樣品分別參加膠板的樣品小槽內，每次加完一個樣品為了避開穿插內，防止碰壞樣品槽四周的凝膠面，每個樣品槽的加樣量不宜過多，本試驗加樣為MarkerλDNA/HindⅢ)電泳DNA片段的最大區(qū)分率，電場強度不應5V/cm。1～2cm處，停頓電泳。染色將電泳后的凝膠浸入EB染液中，進展染色以觀看在瓊脂糖凝膠中的DNA帶。20min后，用大量水沖洗。觀看DNA存在處顯示出紅色熒光條帶。用凝膠自動成像儀處理代替。五、留意事項收集菌體提質粒前，培育基要去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮。Ⅱ后，溶液變成澄清，并有黏性；參加溶液Ⅲ后，消滅絮狀沉淀。苯酚具有腐蝕性，能造成皮膚的嚴峻燒傷及衣物損壞，使用時應留意。如不留神皮膚上遇到苯酚則應用堿性溶液、肥皂及大量的清水沖洗。苯酚可以用于抽提純化DNA，由于苯酚的氧化產物可以使核酸鏈發(fā)生斷裂。所LTris-HCl進展平衡。所以取酚Tris-HCl液隔絕空氣層。酚/氯仿//氯仿/異戊醇抽提后，吸取上清液時留意不要把中間的白色層吸入，其中含有蛋白質等雜質。部棄用，不回收。。因此不要頻繁轉接，每次接種時應挑單菌落。DNADNA后，經瓊脂糖凝膠電泳，圖譜如下：圖中MMarker，4號為本人所提取的質凝膠電泳的檢測圖，本人所用的質分子條帶較為光明，說明所提取的濃度很高；前面原理局部提到，質粒分子的構造多樣，包括超螺旋構造，泳動速度不同，所以在圖譜中顯示有多條不會單獨檢測質粒DNA，或者檢測質粒DNAMarker，這主要是由于質粒分子構造多樣，在電泳圖譜中并不能夠正確顯示其大小。七、思考題裂解細菌時需留意的事項有哪些答：首先留意的是SDS-NaOH處理的時間。質粒制備過程中，假設質粒長時間暴露于NaOH,質粒有可能不行逆變性，使得抽提質粒中有局部是變性質粒。這些變性質粒，SDS-KOH5分鐘，最好在冰里處理，Ⅱ與溶液Ⅲ后溶液的混合肯定要嚴峻，承受上下顛倒的方法，千萬不能在旋轉器上猛烈振蕩，否則會是質粒斷裂，影響提取的效果與濃度。質粒的根本性質有哪些自主復制和轉錄力量；可獨立游離在細胞質內，也可以整合到細菌染色體中。3．堿裂解法提取質粒DNA中各溶液的作用是什么答：溶液Ｉ:GET緩沖液，葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會很快沉積到管EP的底部，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNA受機械剪切力作用而降解。是Ca2＋和Mg2＋等二價金屬離子的螯合劑，在溶液I中參加EDTA，是要把大腸桿菌細胞中的二價金屬離子都螯合掉。從而起到抑制DNase對DNA的降解和抑制微生物生長的作用。溶液Ⅱ：LNaOH(內含1%的SDS)，NaOH是最正確溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是bilayer〔雙層膜〕構造向micelle〔微囊〕SDS是離子型外表活性劑。它主要作用質結合成為R-O-SO3

進展。溶液Ⅲ：乙酸鉀溶液，的乙酸鉀溶液是為了把抽提液的pH調至中性，從而使變性的質粒DNA復性，且穩(wěn)定存在。溶液III參加后的沉淀實際上是K+置換了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-聚合，后者是由于鹽與SDS－蛋白復合物作用后，能形成較小的鹽形式復合物。降解作用，由于蛋白與DNA聯(lián)結鍵已斷，蛋白分子外表又含有很多極性基團與苯酚相像相溶，蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相，使用酚能有效變性蛋白質，抑制的降解作用；氯仿能抑制酚的缺點，加速有機相與液相分層，去除核酸溶〔酚易溶于氯仿中〕；異戊醇的作用是削減蛋白質變性操作過程中產生使離心后的上層含質粒DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。無水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，DNA四周的水分子，DNA失水聚合。70%乙醇：將質粒DNA外表的離子洗去。pHTE緩沖液：由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。酚與水有肯定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸取樣品中含有DNA的水分，削減DNA的損失。用Tris調整至pH8是由于DNA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下RNA比DNA更簡潔游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。DNA的方法包括哪幾個步驟裂解細胞，使蛋白質與DNA變性，利用醋酸鹽沉淀基因組DNA、細胞碎片與蛋白醇與水互溶，而DNA在醇中不行溶而黏在一起，這一步也能除掉鹽分。DNA的產量DNA16小時的菌液狀態(tài)最好，最適合提取，可以在此根底上擴大接種量，等比例擴大LB培育基的體積，實行屢次抽提的方法提高質粒DNA的產量；其次是在提取過程中留神慎重，在參加苯酚/氯仿溶液離心之后留神吸取的同時盡量吸取完全，削減損失。留意些什么TE緩沖液中含有水分，會結成冰晶DNA分子的間隙中，而在4℃條件下不會消滅這種狀況。假設是質粒DNA分子斷裂，導致得到線性4℃冰箱保存，便利使用，而對于臨時-20℃冰箱，長期保存。試驗二DNA的含量、純度與分子量的電泳法測定一、 試驗原理測定核酸通常承受兩種方法：即紫外分光光度法與瓊脂糖凝膠電泳法。紫外分光光度法DNA或RNA定量時，應在260nm280nm兩個波長下讀數(shù)。依據(jù)計算在260nm波1ug/mLDNA鈉鹽的A值為，即在A=1時，雙鏈DNA50ug/mL，單鏈260DNA與RNA40ug/mL，單鏈寡核苷酸的含量為33ug/mL。雙鏈DNA含量＝A×50×稀釋倍數(shù)〔ug/mL〕260×260單鏈DNA含量＝A×33×稀釋倍數(shù)〔ug/mL〕260此外還可以依據(jù)260nm280nm的讀數(shù)間的比值〔A

/A〕估量核酸的純度。瓊脂糖凝膠電泳法

260

280DNA分子量不同，承受外加電場使其分開，用EBDNA分子后在紫外下顯熒光。而熒光強度正比于DNA的含量，如將濃度的標準樣品表2－1作為電泳比照，就可以估量出待測樣品的濃度。電泳后的瓊脂凝膠糖直接在紫外燈下拍工程中常常被用做檢測DNA樣品。片段片段相對分子質量含量/(ng/mg)1 2×1063×1064×10695×1066×1067×1068×106100%二、試驗目的1．從以上試驗中提取到的質粒DNA，為了能作下一步的酶切，連接及轉化試驗，必需測定DNA的純度、含量以及分子量大小。大小。三、試驗材料和試劑材料：自制的質粒DNA、λDNA/HindⅢ、。試劑：EcoRⅠHindⅢ10X緩沖液馬上用大量的水沖洗干凈。5×TBE母液，6．％瓊脂糖四、試驗操作〔一〕質粒DNA的酶解1．提的質粒，在10uL的體系中用單一酶〔如EcoRⅠ〕進展處理，即：質粒DNA 5μL10×緩沖液 1μL

coRⅠ LμddHO 4Lμ2備用?！捕抄傊悄z板的制備瓊脂糖凝膠的制備稱取瓊脂糖，置于錐形瓶中，參加100mLTBE緩沖液，于電爐上加熱，注使其終濃度為1％。膠板的制備個邊腳模子。留意：將橡皮膏緊貼在有機玻璃內槽兩端邊上，不能留空隙。65℃左右的瓊脂糖凝膠，留神地倒在內槽上，掌握灌膠速度，使膠液緩慢地開放，輕拔出樣品槽模板，撕去膠帶紙，膠板上即形成相互隔開的樣品槽?！罷BE電泳緩沖液，以蓋過膠板為宜。膠板內的樣品小槽加樣用移液槍將上述樣品分別參加膠板的樣品小槽內，每次加完一個樣品為了避開穿插內，防止碰壞樣品槽四周的凝膠面，每個樣品槽的加樣量不宜過多，本試驗加樣為MarkerλDNA/HindⅢ)電泳DNA片段的最大區(qū)分率，電場強度不應5V/cm。1～2cm處，停頓電泳。染色將電泳后的凝膠浸入EB染液中，進展染色以觀看在瓊脂糖凝膠中的DNA帶。20min后，用大量水沖洗。觀看DNA存在處顯示出紅色熒光條帶。用凝膠自動成像儀處理代替。五、留意事項吸樣量的正確性，確認樣品確實被參加反響體系。放回－20℃冰箱，不要將酶在冰浴中放置過久，或放在高于0℃以上的環(huán)境中，以防止酶失活。3．酶切加樣次序為水、緩沖液和DNA，然后混勻。酶永久是最終參加的，如將酶直步操作是整個試驗成敗的關鍵，留意防止錯加、漏加。4．為了避開穿插污染，各樣品用不同的吸頭，且每次取酶時務必換吸頭，以免造成限制酶被污染。5．溴化乙錠是一種猛烈的誘變劑，有毒性，使用含有這種染料的溶液時，應戴手套進展操作。勿將溶液滴灑在臺面或地面上，用后用水徹底沖洗干凈。六、試驗結果與分析如下圖，M為Marker1為被酶EcoRI所切后的質粒跑出來的條帶。由于質1只有一條條帶。查資料知道pEGFP-N3質粒的大小為4729bp，大小根本符合。2號泳DNA通過瓊脂糖凝膠時速度不一。由不明顯，說明提取的質粒濃度較小。這三種DNA的相對遷移率主要取決于凝膠濃度，但也受所用電流強度、緩沖液的離子強度及超螺旋度的影響。七、思考題EB顯色的原理。膠中的核酸。是一種核酸染料，常在瓊脂糖凝膠電泳中用于核酸染色，是一種強的誘法使用于一般性的核酸檢測。EB分子可以嵌入核酸雙鏈的配對的堿基之DNA或雙股RNA結合時，螢光強度會增加20倍，使得核酸電泳后的膠片可以辨識核酸的中參加終濃度為μg/ml的EB，可以在電泳過程中隨時觀看核酸的遷移狀況，這種方法使用于一般性的核酸檢測。使用溴化乙錠時應留意什么答：不慎與眼睛接觸后，馬上用大量清水沖洗并征求醫(yī)生意見；穿戴適當?shù)姆雷o服、說明不同電壓對電泳結果的影響是什么答：限制性內切酶消化后的DNA分子片段，低電壓時，遷移率與所用電壓成正比。在電場強度增加時，不同分子量的DNA段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越范圍將縮小。原則上場強度不要超過5V~8V/cm，高電壓可明顯產熱，嚴峻時會引起凝膠熔化或DNA50V左右的低電壓可以讓DNA分子片段沉降到膠和小片段樣本〔簡潔在凝膠中集中消逝，顯色不清〕尤其有利于觀看到清楚結果。為了提高效率，節(jié)約時間，在核酸條帶濃縮集中后〔10~20min〕，可以轉換高電壓100V~時，停頓電泳。綜上，兩種電壓交替使用既提高分別效果，又較好節(jié)余時間。DNA的純度答：DNA純度的推斷依據(jù)OD260/OD280的比值推斷，符合要求純度高的純化DNA其OD260/OD280在之間，低于此范圍說明蛋白質含量超標，高于此范圍說明樣品中含有RNA。試驗三感受態(tài)細胞的制備及轉化一、試驗原理DNA分子。轉化是將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得的遺傳性形，轉化混合物中的DNADNase的羥基－鈣磷酸混合物粘附于細胞外表，DNA復合物，在選擇性培育基平板上培育，可選出所需的轉化子。二、試驗目的學習和理解影響細胞感受態(tài)的因素，把握感受態(tài)細胞的制備方法。把握質粒的轉化方法。把體外DNA引入受體細胞，使受體菌具有遺傳性，并從中選擇出轉化子。三、試驗材料和用具)。試劑：瓊脂平板儀器：蒸汽滅菌鍋。四、操作步驟(一)大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備從活化的α菌平板上挑取一單菌落，接種于5mL液體培育基中，37℃振蕩培1：5050mLLB液體培育基中，37℃快速振蕩培育3～4h。離心10min。溶液輕輕懸浮細胞，冰15～30min。棄上清，參加200μLLCaCl2溶液，留神懸浮細胞，冰上放置片刻，即制成了感受態(tài)細胞懸液。制好的感受態(tài)細胞可在冰上放置。(二)細胞轉化搖勻后的感受態(tài)細胞懸液，進展下一步的轉化，轉化如下〔單位：編號質粒感受態(tài)細胞無菌水LCaCl2樣品2100//1/1002/22//100μL〕：將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置30min42℃水浴中保溫90s，然后快速在冰上冷卻3～5min。上述各管中分別參加400μLLB液體培育基，使總體積胞恢復正常生長狀態(tài)，并使轉化體產生抗藥性。(三)平板培育取各樣品培育液100μL分別接種于含卡那霉素和不含卡那霉素的LB平板培育重疊時停頓培育。質粒比照組轉化試驗組五、留意事項

無菌落長出有大量菌落長出

結果分析不含雜菌質粒進入受體菌中產生抗藥性這一個試驗中的全部操作均要為無菌操作，在超凈工作臺內進展。制備感受態(tài)細胞過程中，需要在冰上放置的肯定不要在室溫中放置。六、試驗結果與分析經過一夜培育后，其次天上午9點從烘箱中取出培育皿觀看結果如以下圖所示，試驗落長出；比照組1即受體菌比照組不含卡那的平板有大量菌落長出，含卡那的平板沒