第八章微生物代謝組學(xué)

第八章微生物代謝組學(xué)（Microbialmetabolomics）及代謝產(chǎn)物庫(kù)（MicrobialMetabolitesLibraries）微生物代謝組學(xué)是指全面分析(定性和定量)細(xì)胞生長(zhǎng)或生產(chǎn)周期某一時(shí)刻細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周?chē)乃械头肿恿看x物.從生物量培養(yǎng)、滅活和代謝產(chǎn)物的提取到代謝物的定量分析分析范圍(nmol-mmol)、化學(xué)功能各異的代謝產(chǎn)物目的：揭示正常狀態(tài)及內(nèi)外環(huán)境變化后代謝過(guò)程動(dòng)態(tài)反應(yīng)規(guī)律。一、微生物代謝組學(xué)代謝組學(xué)(metabolomics)是一種研究生物樣品中所有小分子代謝物的技術(shù)，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后出現(xiàn)的一門(mén)新學(xué)科，已成為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。代謝組學(xué)是通過(guò)考察生物體系受刺激或擾動(dòng)后(如將某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后)所有小分子代謝產(chǎn)物隨時(shí)空的變化情況，來(lái)研究生物體系的代謝途徑的一種技術(shù)。代謝組學(xué)與其它組學(xué)的研究對(duì)象的最大區(qū)別是其研究代謝組的變化。代謝組的變化是生物對(duì)遺傳變異、疾病以及環(huán)境影響的最終應(yīng)答。代謝組學(xué)的突破在于將傳統(tǒng)的代謝途徑擴(kuò)展為代謝網(wǎng)絡(luò)的研究代謝組學(xué)所解決的問(wèn)題非常復(fù)雜：如大腸桿菌的全部代謝產(chǎn)物僅占細(xì)胞干重的3%～5%,但化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的多樣性難以估計(jì),是一般合成化合物和組合化學(xué)產(chǎn)物所不能比擬的,其范圍從小的無(wú)機(jī)離子到疏水性的脂質(zhì)及復(fù)雜的天然產(chǎn)物,濃度范圍跨越9個(gè)數(shù)量級(jí)(從pmol

到mmol)。研究?jī)?nèi)容包括代謝組學(xué)：定性和定量特定條件下生物樣品內(nèi)的全部代謝物。然而,由于代謝物組成復(fù)雜、含量不一，樣品制備過(guò)程的偏差,以及檢測(cè)設(shè)備的量程及通量等問(wèn)題，目前還難以分析全部的代謝物。目標(biāo)代謝物分析(metabolitetargetanalysis)

：利用特定方法研究難分析化合物(difficultanalytes)如植物激素等。代謝譜分析(metaboliteprofiling)：檢測(cè)胞外代謝物代謝指紋分析(metabolicfingerprinting)：對(duì)粗提代謝物進(jìn)行高通量的定性分析，通過(guò)譜型比較將樣品進(jìn)行快速分類(lèi)，尋找差異峰，揭示生物對(duì)疾病或有毒物應(yīng)答的生物標(biāo)記物代謝產(chǎn)物組學(xué)(metabonomics)：多指以核磁共振(NMR)手段研究與疾病相關(guān)的代謝物，是綜合地研究某一時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)全部代謝物的影響代謝組學(xué)的特點(diǎn)：1、能夠?qū)Ω黝?lèi)代謝產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)高通量分析測(cè)定2、上游基因、蛋白層面變化能在下游代謝產(chǎn)物中放大3、代謝產(chǎn)物整體變化可直接反應(yīng)機(jī)體狀態(tài)（一）、微生物代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分共同譯解其全部基因功能，它綜合了分析化學(xué)、基因組學(xué)以及信息科學(xué)的最新進(jìn)展,在功能基因組研究中居于核心地位Catalyst,metabolome,proteome,phenotype

Thesystemsbiologyframeworkrepresentation隨著基因組學(xué)研究的深入,功能基因組開(kāi)始研究基因組、轉(zhuǎn)錄組以及蛋白組的數(shù)據(jù)與表型之間的關(guān)系；而細(xì)胞內(nèi)的全部代謝物最接近于表型,從而產(chǎn)生了研究全部代謝物的要求,代謝組(metabolome)的概念由此誕生Metabolicfootprintingcanresultinimportantbiologicalinformation.Differentyeaststrains(a),bydirectinjectionmassspectrometry(DIMS)(b).furtheranalysedbystatisticaltechniques(c),suchasprincipalcomponentsanalysis(PCA),Discriminantanalysis(d)canthenbeusedtocreateanewvariablebycombiningtheoriginalvariablesinsuchawaythatthedifferencesbetweenthepredefinedgroupsaremaximized,resultingininformationonbiologicalfunctions(e).Classificationofdifferentapproachesofmetabolomicsinvestigationswithrespecttocomprehensionandmetabolitelocalisation（二）、分析過(guò)程代謝組學(xué)研究的技術(shù)平臺(tái)一般流程包括樣品制備、代謝產(chǎn)物的檢測(cè)和分析鑒定、數(shù)據(jù)分析與模型建立Quenched(急劇冷卻)Workflowforquantitativemicrobialmetabolomeanalysisusingmultiplecomprehensiveanalyticalmethods.IS,internalstandard.代謝組學(xué)研究流程Warehousing(入庫(kù))Fig.1Flowdiagramofsamplingprocedure,metabolicactivityquenching,intracellularmetaboliteextraction(endometabolome),extracellularmetabolite(exometabolome)andanalysisproceduresforquantificationsimultaneous(同時(shí)發(fā)生的)１、樣品制備微生物代謝物樣品的制備一般分為微生物培養(yǎng)、淬滅和代謝產(chǎn)物的提取生物量培養(yǎng)技術(shù)1)特殊生長(zhǎng)速率(μ)2)通過(guò)固定特殊生產(chǎn)速率，可固定其他通量,如特殊底物攝取速率(Qs)、O2

攝取速率(OUR)和CO2轉(zhuǎn)化速率(CER)。3)可以加上一個(gè)特殊的生長(zhǎng)限制介質(zhì)組分，如碳源。4)容易完成和再現(xiàn)生理參考穩(wěn)態(tài)條件微生物代謝組學(xué)研究要求微生物的生長(zhǎng)條件是可以控制和重復(fù)的。在一個(gè)生物反應(yīng)器中，需要嚴(yán)格控制溫度、pH、培養(yǎng)基組成、溶解氧和二氧化碳等，以明確界定生長(zhǎng)條件，建立標(biāo)準(zhǔn)的和可重復(fù)的參考培養(yǎng)條件滅活及菌體的獲得滅活的目的是讓細(xì)胞內(nèi)的酶失活,導(dǎo)致代謝物的輪廓“凍結(jié)”。傳統(tǒng)的代謝產(chǎn)物活性快速滅活方式：樣品溫度的瞬間改變至低溫(-40℃)或高溫(>80℃)，或應(yīng)用極端pH的高堿(氫氧化鈉或氫氧化鉀)或高酸(高氯酸、鹽酸或三氯乙酸)完成的。液氮滅活法：把樣品直接投入液氮，冰上解凍后收集菌體細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的提取提取步驟應(yīng)遵循的原則是:以適當(dāng)?shù)幕厥章蕪募?xì)胞中提取最大量的代謝產(chǎn)物。2)代謝產(chǎn)物不應(yīng)該遭遇任何物理和化學(xué)修飾,降解應(yīng)控制在最小范圍內(nèi);3)防止代謝產(chǎn)物丟失和非破壞性。２、代謝產(chǎn)物的分析鑒定傳統(tǒng)的酶法定量胞內(nèi)外代謝物只能分析一個(gè)樣品中的一個(gè)或幾個(gè)代謝物，且需要的樣品體積大。而胞內(nèi)代謝物濃度一般很低，在淬滅或提取過(guò)程中又會(huì)被稀釋?zhuān)玫臉悠敷w積一般很少，這些都將嚴(yán)重影響酶法定量的可靠性代謝組學(xué)定量胞內(nèi)外代謝物的分析方法要求具有高靈敏度、高通量和無(wú)偏向性的特點(diǎn)。(GC-MS)、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）以及核磁共振(NMR)目前，應(yīng)用最廣泛、最有效的技術(shù)是氣相色譜2質(zhì)譜(GC-2MS)和液相色譜2質(zhì)譜(LC-2MS)。這兩種技術(shù)可以檢測(cè)包括糖、糖醇、有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸以及大量次級(jí)代謝物在內(nèi)的數(shù)百種化合物。GC-2MS具有較高的分辨率和靈敏度LC-2MS具有強(qiáng)大的分離能力，廣泛應(yīng)用于難揮發(fā)性物質(zhì)的分析Full-scanGC-MSchromatogramofamicrobialsamplederivatizedbyoximationandsubsequentsylilation(unpublisheddata)３、數(shù)據(jù)分析與模型建立從檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物信息中進(jìn)行兩類(lèi)(如基因突變前后的響應(yīng))或多類(lèi)(如不同表型間代謝產(chǎn)物)的判別分類(lèi)以及生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)色譜、質(zhì)譜、核磁共振技術(shù)及它們的聯(lián)用技術(shù)是代謝物組學(xué)研究中最重要的研究手段，而且這些技術(shù)還在向高通量，高靈敏度，高解析度和高可靠性得到大量的多維的數(shù)據(jù)，這對(duì)它們的分析產(chǎn)生很大的困難，因此需用各種模式識(shí)別技術(shù)來(lái)進(jìn)行簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)復(fù)雜程度并從中找出顯著性因素，進(jìn)而通過(guò)進(jìn)行代謝網(wǎng)絡(luò)建?；蛑亟胺治鰜?lái)解釋得到的結(jié)果，以指導(dǎo)菌種改進(jìn)、植物育種、藥物開(kāi)發(fā)及基因治療等代謝組學(xué)原始數(shù)據(jù)的解析可分為如下3個(gè)基本步驟:(1)提取出色譜分離(如GC2MS)后未能有效分開(kāi)的代謝物峰并得出其相應(yīng)濃度(2)根據(jù)其保留時(shí)間及質(zhì)譜圖等信息鑒別有效峰所代表的化合物(3)根據(jù)代謝數(shù)據(jù)建立代謝網(wǎng)絡(luò)模型。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出界面友好的公開(kāi)軟件，如Sumner等開(kāi)發(fā)的MSFACTS(metabolomicsspectralformatting,alignmentandconversiontools)，可以輸入如GC2MS原始數(shù)據(jù)，輸出代謝物清單。解決該問(wèn)題應(yīng)該更多地依賴(lài)于一些新的算法進(jìn)行自動(dòng)推算，而不是尋找相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)參照物。代謝組學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域(1)植物功能基因組研究,主要以擬南芥為研究模型,也包括一些轉(zhuǎn)基因作物的研究.(2)疾病診斷,根據(jù)代謝物指紋圖譜診斷腫瘤、糖尿病等疾病(3)制藥業(yè),主要通過(guò)高通量比對(duì)預(yù)測(cè)藥物的毒性和有效性,通過(guò)全面分析來(lái)發(fā)現(xiàn)新的生物指示劑(4)微生物領(lǐng)域(5)毒理學(xué)研究,包括利用代謝組學(xué)平臺(tái)研究環(huán)境毒理及藥物毒理(6)食品及營(yíng)養(yǎng)學(xué),即研究食品中進(jìn)入體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分及其與體內(nèi)代謝物的相互作用代謝組學(xué)可研究尿液、血樣、植物提取物及微生物樣品，NovakBJ等采集I型糖尿病患者呼出氣體進(jìn)行分析，找到了與I型糖尿有很強(qiáng)特異性相關(guān)聯(lián)的生物標(biāo)志物硝酸甲酯可用于診斷在疾病分型、藥物毒性評(píng)價(jià)、植物基因功能和表型的研究等取得了進(jìn)展（三）代謝組學(xué)在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用１、微生物分類(lèi),突變體篩選以及功能基因研究某些菌株按照基因型與表型兩類(lèi)方法分類(lèi)會(huì)得出不同的結(jié)果代謝譜分析方法(metabolicprofiling)異軍突起,逐漸成為一種快速、高通量,全面的表型分類(lèi)方法。采用代謝組分類(lèi)時(shí),可以通過(guò)檢測(cè)胞外代謝物來(lái)加以鑒別。常用的胞外代謝物檢測(cè)方法為樣品衍生化后進(jìn)行GC-2MS分析、薄層層析或HPLC-2MS分析,最后通過(guò)特征峰比對(duì)進(jìn)行分類(lèi)Bundy等采用NMR分析代謝譜成功地區(qū)分開(kāi)臨床病理來(lái)源以及實(shí)驗(yàn)室來(lái)源的不同桿菌(bacilluscereus)２、發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化發(fā)酵工藝的監(jiān)控和優(yōu)化需要檢測(cè)大量的參數(shù),利用代謝組學(xué)研究工具可以減少實(shí)驗(yàn)數(shù)量,提高檢測(cè)通量,并有助于揭示發(fā)酵過(guò)程的生化網(wǎng)絡(luò)機(jī)制,從而有利于理性?xún)?yōu)化工藝過(guò)程在接觸葡萄糖底物后的15～25s范圍內(nèi),大腸桿菌體內(nèi)發(fā)生的葡萄糖代謝物變化與經(jīng)典生化途徑相符,但隨后的過(guò)程則與經(jīng)典途徑不符,推測(cè)可能存在新的未知調(diào)控步驟。３、環(huán)境微生物研究微生物降解是環(huán)境中去除污染物的主要途徑深入了解污染物在微生物內(nèi)的代謝途徑,將有助于人們優(yōu)化生物降解的條件,從而實(shí)現(xiàn)快速的生物修復(fù)根際(rhizosphere)空間在植物-微生物相互作用中發(fā)揮著重要的作用。Narasimhan等利用根際代謝物組(rhizosphere

metabolomics)方法,闡釋了植物分泌物對(duì)根際微生物降解多氯代酚(PCB)的作用機(jī)制。二、微生物代謝產(chǎn)物庫(kù)（MicrobialMetabolitesLibraries）微生物是活性天然產(chǎn)物的重要來(lái)源,微生物代謝物具有極大的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和復(fù)雜性建立微生物代謝物庫(kù)對(duì)藥物高通量篩選、發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物有極其重要意義代謝產(chǎn)物庫(kù)是進(jìn)行高通量篩選的先決條件,包括數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)、主要從微生物樣品中提取的活性部位或單體化合物和少量合成化合物1、預(yù)分離代謝物庫(kù)將800種菌株的培養(yǎng)液過(guò)濾,得到培養(yǎng)液的濾液和菌絲體兩部分濾液部分經(jīng)不同吸附性色譜柱處理得到800種強(qiáng)極性組分和6400種中等極性的組分菌絲體部分用有機(jī)溶劑提取得到800種菌絲體提取物采用半制備高效液相對(duì)以上3部分組分進(jìn)一步細(xì)分得到至少80000種純度大于85%的天然化合物最后,對(duì)化合物庫(kù)中活性成分進(jìn)行液相質(zhì)譜、核磁共振分析,排除重復(fù)性物質(zhì)。采用該方法從發(fā)現(xiàn)苗頭化合物到完成結(jié)構(gòu)鑒定所需時(shí)間短菌種來(lái)源多樣性的地域如深地層、深海及極端溫度、鹽度及pH值的地點(diǎn)往往可分離得到新的微生物,為發(fā)現(xiàn)新的化合物提供了可能Mincer

報(bào)道由一種新型放線(xiàn)菌屬Salinospora

可分離得到強(qiáng)抗癌活性物質(zhì)SalinosporamideA培養(yǎng)基成分微生物產(chǎn)生次級(jí)代謝物的種類(lèi)和產(chǎn)量受到培養(yǎng)基成分和生長(zhǎng)條件影響。如:改變培養(yǎng)基中的氮源可使真菌抑制劑Cancidas

的天然前體Pneumocandins

產(chǎn)量提高10～20倍。因此改變微生物生長(zhǎng)條件來(lái)提高菌種代謝產(chǎn)率成為許多制藥公司經(jīng)常使用的策略代謝物分離和檢測(cè)方法2、純天然產(chǎn)物庫(kù)AnalyticonDiscovery和AventisPharmaAG兩公司合作在18個(gè)月內(nèi)建成一個(gè)純度大于80%、包含2242種微生物來(lái)源化合物及1758種植物來(lái)源化合物的無(wú)重復(fù)結(jié)構(gòu)純天然產(chǎn)物庫(kù)3、合成及半合成天然產(chǎn)物庫(kù)隨著高通量有機(jī)合成在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中的應(yīng)用,多種設(shè)計(jì)方法被用于化合物庫(kù)的構(gòu)建,其中包括:通過(guò)全合成獲得天然產(chǎn)物衍生物庫(kù)、天然產(chǎn)物類(lèi)似物庫(kù),及由天然產(chǎn)物而來(lái)的化合物庫(kù)等思考題或討論：1、微生物代謝產(chǎn)物組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)之間的聯(lián)系與區(qū)別？2、微生物代謝組學(xué)的研究方法有哪些？3、如何建立微生物代謝產(chǎn)物庫(kù)？4、建立代謝產(chǎn)物庫(kù)有何意義？參考文獻(xiàn)ValeriaMapelli1,2,LisbethOl