水和飲料中細(xì)菌總數(shù)和總大腸菌群的測定

水和飲料中細(xì)總數(shù)和大腸菌群的測定1、

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1學(xué)習(xí)水樣的采取方法、了解和學(xué)習(xí)水中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的測定原理和測定意義。1.2學(xué)習(xí)和掌握用稀釋平板計(jì)數(shù)法測定水中細(xì)菌總數(shù)的方法。1.3學(xué)習(xí)和掌握水中大腸菌群的檢測方法。2、

實(shí)驗(yàn)原理2.1水中細(xì)菌總數(shù)可說明被有機(jī)物污染的程度，細(xì)菌數(shù)越多，有機(jī)物質(zhì)含量越大。所謂細(xì)菌總數(shù)是指1mL或1g檢樣在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，37℃經(jīng)24h培養(yǎng)后，所生長的菌落數(shù)。本實(shí)驗(yàn)所用的方法是稀釋平板計(jì)數(shù)法，由于計(jì)算的是平板上形成的菌(colony-formingunitcfu)數(shù)故其單位應(yīng)是cfu/g(mL)。它反映的是檢樣中活菌的數(shù)量。2.2所謂大腸菌群，是指在℃、24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌的總稱主要由腸桿菌科中四個(gè)屬內(nèi)的細(xì)菌組成即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。水的大腸菌群數(shù)是指水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實(shí)際數(shù)值大腸菌群最近似數(shù)(MPN)表示。2.3水中大腸菌群的檢驗(yàn)方法，常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可運(yùn)用于各種水樣的檢驗(yàn)但操作繁瑣需要時(shí)間長濾膜法僅適用于自來水和深井水，操作簡單、快速，但不適用于雜質(zhì)較多、易于阻塞濾孔的水樣。多管發(fā)酵法包括：初發(fā)酵試驗(yàn)、平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。2.3.1初發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基并倒置一德漢式小套管乳糖能起選擇作用因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖而大腸菌群能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣培養(yǎng)基內(nèi)加溴甲酚紫作為pH指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基由紫變黃。發(fā)酵管37℃培養(yǎng)24h，小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基渾濁，顏色改變，說明說中存在大腸菌群，為陽性結(jié)果。但是，有個(gè)別其他類型的細(xì)菌此條件下可能產(chǎn)氣，且產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的發(fā)酵管，也不一定非大腸菌群，因其也可能延遲小時(shí)才產(chǎn)氣，這兩種情況應(yīng)視為可疑結(jié)果因此需繼續(xù)進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)才能確定是否為大腸菌群48小時(shí)后仍不產(chǎn)氣的為陰性結(jié)果。2.3.2平板分離伊紅美藍(lán)瓊脂平板含有伊紅和美藍(lán)染料在此亦作為指示劑大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時(shí)，該兩種染料即結(jié)合成復(fù)合物，使大腸菌群產(chǎn)生帶核心的、有金屬光澤的深紫色菌落。初發(fā)酵管24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣和小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的均需在以上平板上劃線分離培養(yǎng)后將符合大腸菌群菌落特征的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，只有染色為革蘭氏陰性、無芽孢桿菌的菌落，才是大腸菌群菌落。2.3.3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)將以上證實(shí)為大腸菌群陽性的菌落，接種復(fù)發(fā)酵，其原理與初發(fā)酵相同，經(jīng)24h培養(yǎng)產(chǎn)酸又產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽性結(jié)果。根據(jù)確定有大腸菌群存在的初發(fā)酵管數(shù)目，查閱專用統(tǒng)計(jì)表，得出總大腸菌群指數(shù)。3、

實(shí)驗(yàn)器材3.1培養(yǎng)基3.1.1普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液蛋白胨10g肉膏糖5g化鈉5g％溴甲酚紫乙醇液1.0mL，蒸餾水1000mL，pH7.2~7.4。將蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.2~7.4，再加入％溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混勻，分裝于有德漢氏小管的試管中，每管10mL，115℃滅菌20min3.1.2三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液按上述普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制裝于有德漢氏小管的試管中，每管5mL。3.1.3伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基（培養(yǎng)基供發(fā)酵法平板分離用）蛋白胨10g，乳10g，KHPO2.0g瓊20g蒸餾水1000mL2％伊紅（曙24紅）水溶液20mL，5％美藍(lán)（亞甲藍(lán)）水溶液，pH7.2~7.4。3.2溶液和試劑自來水、奶茶、池塘水、革蘭氏染色液、無菌水等3.3儀器和其他用品顯微鏡、載玻片、滅菌三角瓶、滅菌帶塞空瓶、滅菌移液管、滅菌試管、德漢氏小管滅菌培養(yǎng)皿。4、

操作步驟4.1水樣的采集：4.1.1自來水先將自來水龍頭用火焰灼燒3分鐘滅菌再開放水龍頭使水流五分鐘后，在火焰旁打開滅菌三角燒瓶瓶塞，接取水樣以備分析。4.1.2池塘水：在距岸邊處，取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。4.1.3奶茶在無菌操作下將已封閉的飲料打開在火焰旁用三角瓶取樣，并迅速進(jìn)行分析4.2水樣中細(xì)菌總數(shù)的檢測4.2.1自來水中細(xì)菌總量的檢測4.2.1.1用滅菌吸管吸取1ml水樣，注入滅菌培養(yǎng)皿中。共做兩個(gè)平皿。4.2.1.2分別傾注約15ml已溶化并冷卻到45度左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基并立即放在平整的桌面上做平面旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。4.2.1.3另取一滅菌培養(yǎng)皿不加水樣傾注牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基15ml，做空白對照。4.2.1.4培養(yǎng)基凝固后，倒置37度，培養(yǎng)時(shí)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。兩個(gè)平板的平均菌落數(shù)，即為1ml水樣的細(xì)菌總數(shù)。4.2.2水樣稀釋及培養(yǎng)：4.2.2.1按無菌操作法，將水樣按10倍稀釋法稀釋。4.2.2.2根據(jù)對水樣污染情況的估計(jì)選擇2-3個(gè)適宜稀釋度奶茶選擇110110011000池塘水選擇1:1001:10001:10000三種稀釋度)，吸取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作個(gè)重復(fù)。4.2.2.3將熔化后保溫度45℃的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平皿，每皿約15mL，并趁熱轉(zhuǎn)動(dòng)平皿混合均勻。4.2.2.4待瓊脂凝固后平皿倒置于℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)后取出，計(jì)算平皿內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得水樣中所含的細(xì)菌菌落總數(shù)。4.2.3稀釋水樣檢測平板的菌落計(jì)數(shù)方法。4.2.3.1平板菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)重復(fù)時(shí)，應(yīng)選取兩個(gè)平板的平均數(shù)。如果一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板計(jì)數(shù)作為該稀釋度的菌數(shù)若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，可計(jì)算半個(gè)平板后乘以代表整個(gè)平板的菌落數(shù)。4.2.3.2稀釋度的選擇：4.2.3.2.1若只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)在30-300之間，則以該稀釋度乘以該稀釋倍數(shù)(表1例1)。4.2.3.2.2若有兩個(gè)稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30-300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小于2，應(yīng)取其平均數(shù)；若比值大于2，則取其中較小的數(shù)字(表l例2、例3)。4.2.3.2．3若所有稀釋度的平均菌落均大于300，則應(yīng)取稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)(表l例4)。4.2.3.2．4若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30、則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(表例5)。4.2.3.2.5若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以該稀釋倍數(shù)報(bào)告之表l例6)。表1計(jì)算菌落總數(shù)方法舉例列次

不同稀釋度的平均菌落數(shù)

兩個(gè)稀釋

菌落數(shù)/

備注度菌落數(shù)

（cfu/mL）10

10

10

之比1136516420-22760295461.632890271602.24無法計(jì)數(shù)1650513-527115-6無法計(jì)數(shù)30512-4.3多管發(fā)酵法測定水中總大腸菌群自來水樣的檢測4.3.1.1初步發(fā)酵試驗(yàn)：

16400或1.6437750或3.8×1027100或2.7×10513000或5.1×10270或2.7×30500或3.1×10

兩位以后的數(shù)字采取四舍五入的方法在2各裝有50mL3倍濃乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的三角瓶中內(nèi)有倒置杜氏小管)，以無菌操作各加水樣100mL。10支裝有5mL的3倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵試管中(內(nèi)有倒置小管)以無菌操作各加入水樣10mL搖勻后℃培養(yǎng)24h，24h未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)48h。4.3.1.2平板分離：將經(jīng)24h培養(yǎng)后產(chǎn)酸產(chǎn)氣及培養(yǎng)后產(chǎn)氣產(chǎn)酸的發(fā)酵管(瓶)別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板(EMB培養(yǎng)基)上℃培養(yǎng)符合下列特征菌落：呈紫黑色具有或略帶有或不帶有金屬光澤或者呈淡紫紅色中心顏色較深；挑取符合上述特征的菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。4.3.1.3復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：將上述經(jīng)染色為革蘭氏陰性無芽胞桿菌的典型菌落的剩余部分接于乳糖蛋白胨發(fā)酵管中為防止遺漏每管可接種來自同一初發(fā)酵管的平板上同類型菌落1—3個(gè)37℃培養(yǎng)24h，如果產(chǎn)酸又產(chǎn)氣者，即證實(shí)有大腸菌群存在。證實(shí)存在后，再根據(jù)初發(fā)酵試驗(yàn)的陽性管（瓶）數(shù)查表，即得總大腸菌群。表2總大腸菌群檢索表

陽

100ml性管

陽

性

管

012每升水樣中總大腸菌群數(shù)

備注0

＜3371114182227313640

48131824303643516069

11182738527092120161230＞230

接種水樣總量300mL（，10mL10份）4.3.2奶茶、池塘水等的檢測4.3.2.1將奶茶水樣稀釋成

-1

10

-2

接種水樣總量中10，0.1，0.01ml各一份，池塘水稀釋成10-2、10、10-4，接種水樣總量1.111ml，其中1，0.1，0.01,0.001ml各一份。4.3.2.2分別吸取各稀釋度的水樣和1ml原水樣各注入裝有乳糖蛋白胨發(fā)酵管中。另取10ml和100ml原水樣，分別注入裝有5ml和50ml3倍濃度乳糖蛋白發(fā)酵液的試管（瓶）中。混勻后，℃培養(yǎng)24h，24h產(chǎn)氣繼續(xù)培養(yǎng)至48h。4.3.2.3以下步驟與上述自來水檢測的平板分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)相同。證實(shí)有大腸菌群存在后，將奶茶水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表3將池塘水樣的發(fā)酵管結(jié)果查表4。表3總大腸菌群檢索表（中度污染水）接種水樣量/mL

每升水樣中大備注10---

1---

0.1--+

0.01-+-

腸菌群數(shù)＜909090接種水樣總量--

+-

-+

-+

95180

為（10，0.1，0.01mL一份）--+

++-

-+-

+--

190220230