分析化學(xué)第9章吸光光度法

第九章

吸光光度法§9.1吸光光度法基本原理§9.2光度計(jì)及其基本部件§9.3顯色反應(yīng)與條件的選擇§9.4吸光度測量條件的選擇§9.5吸光光度法的應(yīng)用§9.6紫外吸收光譜法簡介spectrophotometry2023/2/42023/2/4吸光光度法概述吸光光度法：基于物質(zhì)對光的選擇性吸收的分析方法比色法可見分光光度法（visiblespectrophotometry）紫外分光光度法（ultravioletspectrophotometry）

其他2023/2/4特點(diǎn)：(1)具有較高的靈敏度，適用于微量組分的測定。(2)通常所測試液的濃度下限達(dá)10-5~10-6mol·L-1。(3)吸光光度法測定的相對誤差約為2%~5%。(4)測定迅速，儀器操作簡單，價格便宜，應(yīng)用廣泛(5)幾乎所有的無機(jī)物質(zhì)和許多有機(jī)物質(zhì)的微量成分都能用此法進(jìn)行測定。(6)還常用于化學(xué)平衡等的研究。2023/2/4§9.1吸光光度法基本原理9.1.1

物質(zhì)對光的選擇性吸收M+熱M+熒光或磷光M+

h

M

*基態(tài)激發(fā)態(tài)E1

（△E）E2

E=E2-

E1=h

量子化；選擇性吸收;

分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使其對不同波長光的吸收程度不同；光的互補(bǔ)：藍(lán)黃2023/2/4表9-1物質(zhì)顏色與吸收光顏色的互補(bǔ)關(guān)系2023/2/4電子能級間躍遷電子能級間躍遷的同時總伴隨有振動和轉(zhuǎn)動能級間的躍遷。即電子光譜中總包含有振動能級和轉(zhuǎn)動能級間躍遷產(chǎn)生的若干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶。2023/2/4吸收曲線與最大吸收波長分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使其對不同波長光的吸收程度不同，用不同波長的單色光照射，測吸光度—

吸收曲線與最大吸收波長

max；（動畫）2023/2/4吸收曲線的討論：（1）同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應(yīng)的波長稱為最大吸收波長λmax（2）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似λmax不變。而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。（動畫）（3）吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。2023/2/4吸收曲線的討論：（動畫）（4）不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。（5）在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。2023/2/49.1.2光的吸收基本定律

──朗伯-比耳（Larnbert-Beer）定律1.朗伯—比耳定律吸光度與液層厚度

A∝b吸光度與物質(zhì)濃度A∝cA∝cb（動畫1）（動畫2）2023/2/4式中A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L-１；

κ：摩爾吸收系數(shù)，單位L·mol-１·cm-１；或:A=lg(I0/It)=abc

c：溶液的濃度，單位g·L-１

a：吸收系數(shù)，單位L·g-１·cm-１

a與κ的關(guān)系為：

a=κ

/M（M為摩爾質(zhì)量）

朗伯—比耳定律數(shù)學(xué)表達(dá)式2023/2/4透過度T

:描述入射光透過溶液的程度

T=I

/I0吸光度A與透射比T的關(guān)系:透射比T(1)吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測定的依據(jù)。(2)

摩爾吸收系數(shù)κ在數(shù)值上等于濃度為1mol·L-1、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度；(3)吸光度具有加和性。2023/2/4（1）吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)；（2）不隨濃度c和光程長度b的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時，κ僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測物濃度無關(guān)；（3）同一吸收物質(zhì)在不同波長下的κ值是不同的。在最大吸收波長λmax處的摩爾吸收系數(shù)κmax表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度。

摩爾吸收系數(shù)κ的討論2023/2/4（4）可作為定性鑒定的參數(shù)；（5）物質(zhì)的吸光能力的度量

κmax越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)，用光度法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。κ

>105：超高靈敏；

κ

=(6～10）×104

：高靈敏；

κ

=104～103

：中等靈敏；

κ

<103：不靈敏。（6）κ在數(shù)值上等于濃度為1mol·L-1、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。

摩爾吸收系數(shù)ε的討論2023/2/49.1.3偏離比耳定律的原因1.現(xiàn)象

標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時），這種現(xiàn)象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。2.引起偏離的因素（兩大類）

（1）物理性因素，

即儀器的非理想引起的；

（2）化學(xué)性因素。2023/2/4物理性因素：難以獲得真正的純單色光。

分光光度計(jì)只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復(fù)合光可導(dǎo)致對朗伯—比耳定律的正或負(fù)偏離。

非單色光、雜散光、非平行入射光都會引起對朗伯—比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。

2023/2/4非單色光作為入射光引起的偏離：假設(shè)由波長為λ1和λ2的兩單色光組成的入射光通過濃度為c的溶液，則：

A1＝lg（Ｉ01/Ｉt1）＝κ1

bc

A2＝lg(Ｉ02/Ｉt2）＝κ2bc故：式中：Ｉ01、Ｉ02分別為λ1、λ2的入射光強(qiáng)度；

Ｉt1

、Ｉt2分別為λ1、λ2的透射光強(qiáng)度；

κ1、κ2分別為λ1、λ2的摩爾吸收系數(shù)；2023/2/4

A總=lg（Ｉ0總/Ｉt總)

=lg(I01

+Ｉ02)/(Ｉt1

+Ｉt2

）

=lg(I01

+Ｉo2)/(Ｉ01

10-κ1bc

+Ｉ02

10-κ2bc

）令：κ1-κ2=κ

；設(shè)：Ｉ01

=Ｉ02

A總=lg(2I01)/Ｉt1(1+10-κbc

）

=

A1+lg2-lg(1+10-κbc

)

因?qū)嶋H上只能測總吸光度A總，故2023/2/4討論：

A總=A1+lg2-lg(1＋10－κbc

)

(1)=0；即：κ1=κ2=κ

則：

A總

＝lg（Ｉo/Ｉt）＝κbc(2)κ

≠0

若κ

<0；即κ2<κ1；－κbc>0,

lg(1＋10κbc)值隨c值增大而增大，則標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離直線向c軸彎曲，即負(fù)偏離；反之，則向A軸彎曲，即正偏離。2023/2/4討論：

(3)｜κ

｜很小時，即κ1≈κ2：

可近似認(rèn)為是單色光。在低濃度范圍內(nèi)，不發(fā)生偏離。若濃度較高，即使｜κ

｜很小，A總

≠Ａ1

，且隨著c值增大，

A總

與A1的差異愈大，表現(xiàn)為A-c曲線上部(高濃度區(qū))彎曲愈嚴(yán)重。故朗伯-比耳定律只適用于稀溶液。

(4)為克服非單色光引起的偏離，首先應(yīng)選擇比較好的單色器。此外還應(yīng)將入射波長選定在待測物質(zhì)的最大吸收波長且吸收曲線較平坦處。2023/2/4討論：

選用譜帶a的復(fù)合光進(jìn)行測量，得到右圖的工作曲線，A與c基本呈直線關(guān)系。選用譜帶b的復(fù)合光進(jìn)行測量，κ的變化較大，則A隨波長的變化較明顯，得到的工作曲線明顯偏離線性。2023/2/4(2)化學(xué)性因素朗伯—比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點(diǎn)之間不發(fā)生相互作用；僅在稀溶液(c<10-2mol·L-1)時才基本符合。當(dāng)溶液濃度c>10-2

mol·L-1時，吸光質(zhì)點(diǎn)間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對光的吸收。

故：朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。

溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學(xué)平衡時。使吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度發(fā)生變化。

例：CrO42-+2H+

=Cr2O72-+H2O2023/2/4§9.2光度計(jì)及其基本部件1.分光光度計(jì)2023/2/4分光光度計(jì)2023/2/49.2.1

基本組成（動畫）光源單色器樣品室檢測器顯示2023/2/49.2.2

主要部件

1.光源

在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。2023/2/42.單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任意波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光;棱鏡或光柵2023/2/4光柵2023/2/43.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。2023/2/44.檢測系統(tǒng)

將光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換成電流來進(jìn)行測量。光電檢測器。要求：對測定波長范圍內(nèi)的光有快速、靈敏的響應(yīng)，產(chǎn)生的光電流應(yīng)與照射于檢測器上的光強(qiáng)度成正比。(1)光電管2023/2/4(2)光電二極管陣列電容器再次充電的電量與每個二極管檢測到的光子數(shù)目成正比，而光子數(shù)又與光強(qiáng)成正比。通過測量整個波長范圍內(nèi)光強(qiáng)的變化就可得到吸收光譜。電容器充電電容器放電光照射再次充電測量周期2023/2/4§9.3顯色反應(yīng)與條件的選擇9.3.1

顯色反應(yīng)的選擇1.選擇顯色反應(yīng)時，應(yīng)考慮的因素

靈敏度高、選擇性高、生成物穩(wěn)定、顯色劑在測定波長處無明顯吸收，兩種有色物最大吸收波長之差：“對比度”，要求△>60nm。2.配位顯色反應(yīng)

當(dāng)金屬離子與有機(jī)顯色劑形成配合物時，通常會發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移躍遷，產(chǎn)生很強(qiáng)的紫外—可見吸收光譜2023/2/43.氧化還原顯色反應(yīng)

某些元素的氧化態(tài)，如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ）在紫外或可見光區(qū)能強(qiáng)烈吸收，可利用氧化還原反應(yīng)對待測離子進(jìn)行顯色后測定。

例如：鋼中微量錳的測定，

2Mn2＋＋5S2O82-＋8H2O=2MnO4＋+10SO42-＋16H+

將Mn2＋

氧化成紫紅色的MnO4＋后，在525nm處進(jìn)行測定。2023/2/49.3.2顯色劑無機(jī)顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨等。有機(jī)顯色劑：種類繁多偶氮類顯色劑：性質(zhì)穩(wěn)定、顯色反應(yīng)靈敏度高、選擇性好、對比度大，應(yīng)用最廣泛。偶氮胂III、PAR等。三苯甲烷類：鉻天青S、二甲酚橙等2023/2/49.3.3顯色反應(yīng)條件的選擇1.顯色劑用量

吸光度A與顯色劑用量cR的關(guān)系會出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。2.反應(yīng)體系的酸度

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，分別測定不同pH值條件下顯色溶液的吸光度。選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區(qū)所對應(yīng)的pH范圍。3.顯色時間與溫度

實(shí)驗(yàn)確定4.溶劑2023/2/45.干擾的消除

光度分析中，共存離子如本身有顏色，或與顯色劑作用生成有色化合物，都將干擾測定。（1）加入配位掩蔽劑或氧化還原掩蔽劑

使干擾離子生成無色配合物或無色離子（2）選擇適當(dāng)?shù)娘@色條件以避免干擾

用磺基水楊酸測定Fe3+離子時,Cu2+與試劑形成黃色絡(luò)合物,干擾測定，但如控制pH在2.5左右，Cu2+則不與試劑反應(yīng)。（3）分離干擾離子2023/2/49.3.3三元配合物在光度分析中

的應(yīng)用特性簡介

由一種金屬離子同時與兩種不同的配位體形成的三元配合物具有下列分析特性：1.穩(wěn)定，可提高分析測定的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性

例:Ti-EDTA-H2O2三元配合物的穩(wěn)定性，比Ti-EDTA和Ti-H2O2二元配合物的穩(wěn)定性，分別增強(qiáng)約1000倍和100倍。2.比二元配合物具有更高的靈敏度和更大的對比度

靈敏度通?？商岣?~2倍，有時甚至提高5倍以上。3.比二元體系具有更高的選擇性

減少了金屬離子形成類似配合物的可能性。2023/2/4§9.4吸光度測量條件的選擇9.4.1選擇適當(dāng)?shù)娜肷洳ㄩL

一般應(yīng)該選擇λmax為入射光波長。如果λmax處有共存組分干擾時，則應(yīng)考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長。

如圖選500nm波長測定，靈敏度雖有所下降，卻消除了干擾，提高了測定的準(zhǔn)確度和選擇性。2023/2/49.4.2參比溶液的選擇為什么需要使用參比溶液？

測得的的吸光度真正反映待測溶液吸光強(qiáng)度。選擇參比溶液所遵循的一般原則：⑴若僅待測組分與顯色劑反應(yīng)產(chǎn)物在測定波長處有吸收，其他所加試劑均無吸收，用純?nèi)軇ㄋ?作參比溶液；2023/2/4⑵若顯色劑或其他所加試劑在測定波長處略有吸收,而試液本身無吸收，用“試劑空白”(不加試樣溶液)作參比溶液；⑶若待測試液在測定波長處有吸收，而顯色劑等無吸收，則可用“試樣空白”(不加顯色劑)作參比溶液；⑷若顯色劑、試液中其他組分在測量波長處有吸收,則可在試液中加入適當(dāng)掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑，作為參比溶液。2023/2/49.4.3吸光度讀數(shù)范圍的選擇不同的透射比讀數(shù)，產(chǎn)生的誤差大小不同：

－lgT=κbc微分：－dlgT＝－0.434dlnT=-0.434T-1

dT

=κbdc兩式相除得：Δc/c不僅與儀器的透射比誤差ΔT有關(guān)，而且與其透射比讀數(shù)T的值也有關(guān)。是否存在最佳讀數(shù)范圍？何值時誤差最?。?023/2/4最佳讀數(shù)范圍與最佳值:設(shè)：ΔT=1%，Δc/c~T關(guān)系曲線T在20%～65%之間時,濃度相對誤差較小，最佳讀數(shù)范圍濃度相對誤差最小時的透射比Tmin為：

Tmin＝36.8%,Amin＝0.434

通過改變吸收池厚度或待測液濃度，使吸光度讀數(shù)處在適宜范圍。普通分光光度法不適于高含量或極低含量物質(zhì)的測定。2023/2/4§9.5吸光光度法的應(yīng)用9.5.1普通分光光度法1.單組分的測定

A-c

標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定。2.多組分的同時測定

⑴各組分的吸收曲線不重疊

⑵各組分的吸收曲線互有重疊根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。

Aλ1

=κaλ1

bca＋κbλ1bcb

Aλ2

=κaλ2

bca＋κbλ2bcb

2023/2/49.5.2高含量組分的測定──示差法設(shè)：待測溶液濃度為cx，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為cs(cs<cx)。則：

Ax=κb

cx

As=κbcs

Ar=ΔＡ=Ａx－Ａs=κb(cx－cs）=κbΔc繪制Ar

~Δc工作曲線，再根據(jù)cx=cs+Δc計(jì)算試樣濃度。2023/2/4示差法為什么能較準(zhǔn)確地測定高濃度組分呢？普通光度法:

cs:Ts=10%，cx

:Tx=5%，示差法:

cs

:Ts=100%，cx:Tr=50%，

透射比讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)大了十倍。讀數(shù)落入適宜讀數(shù)范圍內(nèi)，提高了測量的準(zhǔn)確度。2023/2/4示差法的濃度相對誤差：

隨著參比溶液濃度增加，即Ts減小，濃度相對誤差減小。示差法要求儀器光源有足夠的發(fā)射強(qiáng)度或能增大光電流放大倍數(shù)，以便能調(diào)節(jié)參比溶液透射比為100%。2023/2/49.5.3光度滴定

光度測量用來確定滴定終點(diǎn)。靈敏，并可克服目視滴定法中的干擾。終點(diǎn)由直線外推法得到，可用于平衡常數(shù)較小的滴定反應(yīng)。2023/2/49.5.4酸堿離解常數(shù)的測定用于測定對光有吸收的弱酸（堿）的離解常數(shù)。

HL=H++L-

(1)配制一系列總濃度(c)相等，而pH不同的HL溶液(2)測定各溶液的pH值。(3)在酸式(HL)或堿式(L-)最大吸收波長處，測吸光度。2023/2/4根據(jù)分布系數(shù)的概念(4)假設(shè)高酸度時，弱酸全部以酸式形式存在，則:

AHL=κHLc(5)在低酸度時，弱酸全部以堿式形式存在，則:

AL=κLc2023/2/4光度法測定一元弱酸離解常數(shù)的基本公式。2023/2/49.5.5配合物組成及穩(wěn)定常數(shù)的測定摩爾比法

M+nL=MLn(1)測定金屬離子濃度cM固定，而配位體濃度cL逐漸改變的不同溶液的吸光度。作圖(2)當(dāng)cL/cM＜n時，配位不完全當(dāng)cL/cM＞n時，配位完全2023/2/49.5.6雙波長分光光度法兩束光交替照射：試液本身作參比液。主要應(yīng)用：(1)多組分混合物的測定(2)混濁樣品的測定(3)反應(yīng)動力學(xué)過程研究2023/2/4§9.6紫外吸收光譜法簡介

9.6.1有機(jī)化合物電子躍遷的類型

有機(jī)化合物三種價電子：σ、π、n電子。分子軌道理論：一個成鍵軌道→反鍵軌道。外層電子均處于分子軌道的基態(tài)(成鍵或非鍵軌道)。外層電子吸收紫外或可見輻射后，從基態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)躍遷。四種躍遷:

n→π＊<π→π＊<n→σ＊

<σ→σ＊2023/2/41.σ→σ＊躍遷

所需能量最大。飽和烷烴的分子吸收光譜出現(xiàn)在遠(yuǎn)紫外區(qū)(λmax<200nm，只能被真空紫外分光光度計(jì)檢測到)。甲烷的λmax為125nm,乙烷λmax為135nm。2.n→σ＊躍遷所需能量較大。吸收波長為150～250nm，遠(yuǎn)紫外區(qū)。含非鍵電子的飽和烴衍生物(含N、O、S和鹵素等雜原子)均呈現(xiàn)n→σ*躍遷。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n→σ*躍遷的λmax分別為173nm、183nm和227nm。2023/2/43.π→π＊躍遷所需能量較小，近紫外區(qū)，κmax>104L·mol

-1·cm-1以上，強(qiáng)吸收。不飽和烴、共軛烯烴和芳類均可發(fā)生該類躍遷。乙烯π→π*躍遷的λmax為162nm，κmax為:1×104L·mol-1·cm-1共軛烯炔中的躍遷的吸收峰稱K吸收帶。苯環(huán)上的躍遷產(chǎn)生三個譜帶：E1帶（λmax

~180nm，κmax＞104），E2帶（λmax

~200nm，κmax~104）和B帶（λmax

~278nm，κmax=10~103）。用于芳香化合物的鑒別。2023/2/44.n→π＊

躍遷需能量最低，吸收波長λmax>200nm。屬禁阻躍遷。摩爾吸收系數(shù)：10～100L·mol-1·cm-1，強(qiáng)度較弱。分子中孤對電子和π鍵同時存在時發(fā)生n→π＊

躍遷。丙酮n