全基因組關(guān)聯(lián)分析影響豬GLU和GSP的染色體位點(diǎn),畜牧獸醫(yī)論文

全基因組關(guān)聯(lián)分析影響豬GLU和GSP的染色體位點(diǎn),畜牧獸醫(yī)論文【研究意義】血液中的血糖〔glucose，GLU〕循環(huán)全身，對人體具有重要的生理功能，是反映機(jī)體生理狀況的一個重要指標(biāo)?？崭寡菨舛取瞗astingserumglucose,FSG〕是糖尿病臨床診斷的常規(guī)指標(biāo)，也是糖尿病診斷后10年內(nèi)因心血管疾病死亡的獨(dú)立預(yù)警指標(biāo)。糖尿病病人的空腹血糖濃度持續(xù)偏高，波動較小，是一種營養(yǎng)代謝性疾病。有研究表示清楚，空腹血糖濃度是可遺傳的，遺傳力為0.620.08〔P＜0.01〕，屬于高遺傳力性狀。糖基化血清蛋白〔glycosylatedserumproteins，GSP〕是一個比血糖更穩(wěn)定、更能反映機(jī)體23周內(nèi)平均血糖水平的指標(biāo)。豬作為形式動物，與人類具有類似的代謝功能、心血管系統(tǒng)、成比例的器官大小等，已經(jīng)成為研究人類肥胖、糖尿病及并發(fā)癥等疾病的最佳形式動物。研究影響豬GLU和GSP的染色體位點(diǎn)及候選基因定位，不僅對豬代謝生理功能的遺傳解析具有重要意義，而且對人類相關(guān)疾病的臨床研究具有參考價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來，已定位了多個影響GLU和GSP的QTL。Cai等在對西班牙裔兒童研究中發(fā)現(xiàn)，影響空腹血糖濃度的QTL定位在13號染色體的8599cM處；An等在人19號染色體的88cM處定位到了顯著影響空腹血糖濃度的QTL，在7號染色體的163cM處定位到了染色體可顯著影響空腹血糖濃度的QTL；Kobayashi等在由SMSMXA-5構(gòu)建的F2小鼠中，在8號染色體上定位到了影響空腹血糖濃度的QTL。人和鼠的血糖性狀QTL定位結(jié)果具有很高的一致性。在對豬的研究中，Yoo等利用長白韓國本地豬種F2群體，在SSC1和SSC8上定位到染色體可顯著影響GLU的QTL；Dsauts等利用梅山豬和大白豬構(gòu)建的F2群體在SSC1、3、5、8四條染色體上定位到了影響GLU濃度的QTL；陳蓉蓉等在白色杜洛克二花臉資源家系SSC14的68cM處定位到了1個5%基因組顯著影響GLU的QTL。由豬QTL數(shù)據(jù)庫可知，影響GSP的QTL定位較少，當(dāng)前只要在SSC4的54cM處發(fā)現(xiàn)一個染色體顯著水平QTL?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】當(dāng)前，尚未見利用Illuminaporcine60KSNP芯片進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析定位影響豬GLU和GSP染色體位點(diǎn)的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用豬60KSNP芯片，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析來定位影響豬GLU和GSP的染色體位點(diǎn)，為進(jìn)一步鑒別影響豬GLU和GSP的主效基因和因果突變位點(diǎn)提供研究基礎(chǔ)，為人類低血糖癥和糖尿病的遺傳學(xué)研究提供參考。1材料與方式方法本試驗(yàn)于2018年3月至2020年9月在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地進(jìn)行。1.1試驗(yàn)動物試驗(yàn)豬為中國培育豬種蘇太豬和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地構(gòu)建的白色杜洛克二花臉F2資源家系。F2資源家系以2頭白色杜洛克公豬和17頭二花臉母豬為F0始祖，雜交產(chǎn)生F1代。隨機(jī)選擇9頭F1公豬和59頭F1母豬，分六批次共繁育1912頭F2個體，華而不實(shí)760頭F2個體〔411頭公豬，349頭母豬〕屠宰時采集血液，分離血清用于GLU和GSP測定。所有F2仔豬46d斷奶，公豬90d閹割。435頭蘇太豬〔228頭公豬和207頭母豬〕購自蘇州市蘇太育種中心，18d閹割，28d斷奶。兩品種豬按統(tǒng)一常規(guī)方式方法飼養(yǎng)，采食一樣飼料，自由采食和飲水。〔2405〕日齡禁食禁水24h后進(jìn)行屠宰取樣。1.2血清GLU和GSP含量測定血液樣品在室溫下靜置5h，4℃3000r/min離心20min，分離血清保存于-80℃待測。血清樣品送至南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院使用全自動生化分析儀〔AU5421，美國貝克曼庫爾特〕測定GLU和GSP含量。1.3DNA提取及60KSNP芯片判型采集0.51.0g豬耳組織，根據(jù)常規(guī)酚/氯仿法提取基因組DNA。用NANODROP1000核酸蛋白分析儀〔ThermoScientific，USA〕測定DNA濃度和質(zhì)量，A260/280的比值在1.82.0斷定合格，將濃度統(tǒng)一稀釋至20ngL-1，-20℃冰箱保存。DNA樣品利用IlluminaBeadArraySNP基因分型平臺進(jìn)行豬60KSNP芯片分型〔北京怡美通德科技發(fā)展有限公司〕。利用PLINK軟件對SNP進(jìn)行質(zhì)控，將檢測率95.0%、次等位基因頻率〔minorallelefrequency〕0.05且符合家系分離規(guī)律的SNP標(biāo)記用于后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析。1.4統(tǒng)計(jì)分析采用廣義線性混合模型斷定各個SNP與表型性狀之間關(guān)聯(lián)性，分析模型為：y=+Xb+Sc+Z+e。華而不實(shí)，為性狀平均值，b為性別和批次的固定效應(yīng)向量，c為其余的微效應(yīng)，為隨機(jī)加性遺傳效應(yīng)向量，e為殘差，X、S和Z是對固定效應(yīng)和隨機(jī)效應(yīng)的關(guān)聯(lián)矩陣，y為所測得的表型值，利用R語言中的GenABEL軟件包進(jìn)行GWAS分析。整合F2資源家系和蘇太豬共有的34495個通過質(zhì)量控制的SNP進(jìn)行GLU和GSP性狀的MetaGWAS分析，當(dāng)自由度為3時，根據(jù)每一個SNP位點(diǎn)在每個群體中的卡方值〔x2〕計(jì)算合并的新的x2值，利用Bonferroni校正多重檢驗(yàn)確定顯著性閾值，基因組顯著水平閾值為0.05/有效SNP數(shù)量，染色體顯著水平閾值為1/有效SNP位點(diǎn)數(shù)量。1.5位置候選基因搜索利用Ensemb或NCBI豬參考基因組數(shù)據(jù)庫中搜索關(guān)聯(lián)性顯著的SNP所在區(qū)域的已經(jīng)知道基因信息，根據(jù)基因注釋情況分析可能的位置候選基因。2結(jié)果2.1血清GLU和GSP含量測定蘇太豬和F2資源家系血清GLU和GSP含量測定結(jié)果見表1。兩個群體通過質(zhì)控的有效表型數(shù)據(jù)個體數(shù)分別為682頭和393頭；從表中能夠看出，F(xiàn)2資源家系血清平均GLU濃度高于蘇太豬，平均GSP濃度低于蘇太豬。【表1】2.2全基因組關(guān)聯(lián)分析GLU和GSP兩性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表2。本試驗(yàn)共檢測到3個SNP位點(diǎn)與GSP相關(guān)，2個SNP位點(diǎn)與GLU相關(guān)，這些SNP與表型的關(guān)聯(lián)性只到達(dá)染色體顯著水平?！颈?】在白色杜洛克二花臉F2資源群體中，10號染色體上的SNPALGA0057739與血清GSP含量的關(guān)聯(lián)性達(dá)染色體顯著水平〔P=1.5810-5，圖1〕，該SNP解釋表型變異為3.72%，位于染色體24.67Mb處，ASPM基因距離該SNP近期〔10.33kb〕。在蘇太豬群體中，檢測到兩個與GSP達(dá)染色體顯著水平的SNP〔ALGA0108699和DRGA0017552，P=1.4510-5，圖2〕，SNP所解釋的表型變異均為3.72%。使用豬10.2版本參考基因組序列，這兩個SNP均無法定位到詳細(xì)的染色體位置〔表2〕。通過人、豬比擬基因組分析發(fā)現(xiàn)，這兩個SNP均位于SSC8，處于STPG2基因3下游180.3193.0kb處。將兩個試驗(yàn)豬群體合并，對GSP性狀進(jìn)行Meta分析，并未發(fā)現(xiàn)與GSP顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)〔圖3〕。在白色杜洛克二花臉F2資源家系和蘇太豬兩個群體中分別進(jìn)行GWAS分析，并未定位到與血清GLU含量顯著相關(guān)的SNP。兩個群體進(jìn)行Meta分析時，1號染色體250.32Mb處的SNPDRGA0002021與GLU的關(guān)聯(lián)性達(dá)染色體顯著水平〔P=2.4810-5〕，SNP位于TRPM3基因內(nèi)；在14號染色體43.97Mb處也分析得到一個達(dá)染色體顯著水平的SNP〔ASGA0062984，P=1.2910-5〕，SNP位于KCTD10基因內(nèi)〔圖4〕。3討論本試驗(yàn)在蘇太豬和F2資源群體檢測到3個SNP與血清GSP含量顯著相關(guān)，但定位結(jié)果與Chen等在一樣F2資源群體中基于194個微衛(wèi)星標(biāo)記的QTL定位結(jié)果不一致。QTL定位分析與全基因組關(guān)聯(lián)分析是不同的，首先QTL定位分析是基于QTL的兩個等位基因在F0始祖中固定這個假設(shè)基礎(chǔ)上進(jìn)行的，全基因組關(guān)聯(lián)分析無此假設(shè)，因而即便QTL在始祖中分離，GWAS也能檢測到該顯著性位點(diǎn)；在GWAS分析中，僅考慮了加性效應(yīng)，而在QTL定位中同時考慮了加性和顯性效應(yīng)；GWAS分析中使用的SNP標(biāo)記的密度遠(yuǎn)大于194個微衛(wèi)星標(biāo)記。在蘇太豬和F2資源群體中檢測到的與GSP顯著關(guān)聯(lián)的SNP不一致，表示清楚影響GSP的染色體位點(diǎn)存在群體異質(zhì)性。本試驗(yàn)在蘇太豬和F2資源群體中均未檢測到與GLU顯著相關(guān)的SNP，可能是群體樣本數(shù)量缺乏導(dǎo)致。本試驗(yàn)獲得的關(guān)聯(lián)性顯著相關(guān)的SNP其解釋的表型變異5%，要檢測到效應(yīng)較小的染色體位點(diǎn)需要較大的群體規(guī)模。另外與GSP相比，血清中GLU的含量更易遭到環(huán)境等因素的影響。對于某些染色體位點(diǎn)，假如對不同群體同一性狀具有一樣的作用，通過合并不同群體進(jìn)行Meta分析能夠起到增加群體樣本規(guī)模的作用，有可能發(fā)現(xiàn)新的顯著性位點(diǎn)。本試驗(yàn)合并兩個群體進(jìn)行兩個性狀的Meta分析，結(jié)果在SSC1和SSC14定位到了2個與GLU顯著關(guān)聯(lián)的SNP，華而不實(shí)SSC14上顯著關(guān)聯(lián)的SNP位于Chen等報(bào)道的影響GLU的QTL置信區(qū)間內(nèi)，SSC1上定位到顯著關(guān)聯(lián)的SNP與Dsauts等報(bào)道的影響GLU的QTL處于同一染色體區(qū)域。Meta分析未發(fā)現(xiàn)新的與GSP顯著相關(guān)的SNP。利用豬參考基因組信息〔10.2版〕，搜索了離關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)SNP近期的基因。對于SSC10，24.67Mb處顯著影響GSP的SNP，在Ensembl上搜索到ASPM基因離其近期〔10.33kb〕，在GeneCards搜索這個位置候選基因的功能，發(fā)現(xiàn)ASPM可通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路而影響大腦發(fā)育，Wnt信號通路與糖尿病密切相關(guān)，因而ASPM基因是該染色體區(qū)域的重要候選基因。SSC1上與GLU顯著關(guān)聯(lián)的SNPDRGA0002021位于TRPM3基因內(nèi)，TRPM3與鈣離子通道介導(dǎo)的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞有關(guān)，在鈣離子介導(dǎo)的非選擇性通道中廣泛表示出，TRPM(melastatin)與血糖穩(wěn)態(tài)和代謝綜合征相關(guān)。Wagner等研究小鼠胰腺細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)時發(fā)現(xiàn)，TRPM3基因介導(dǎo)孕烯醇酮磷酸化刺激胰島素分泌，TRPM3基因調(diào)節(jié)胰島素的分泌和生物合成。因而，TRPM3是與GLU相關(guān)的一個重要候選基因。對于SSC14，43.97Mb上與GLU顯著關(guān)聯(lián)的ASGA0062984位于KCTD10基因內(nèi)，KCTD10基因與MVK、MMAB基因嚴(yán)密相鄰，已證實(shí)含有該基因的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化相關(guān)，是一個重要的候選基因。離SSC8與GSP顯著相關(guān)的SNPALGA0108699和DRGA0017552近期的STPG2