分子生物學(xué)第09章DNA分子標(biāo)記技術(shù)

9.1基于Southern雜交技術(shù)的分子標(biāo)記9.2隨機(jī)（或半隨機(jī)）引物分子標(biāo)記技術(shù)9.3序列標(biāo)志位點(diǎn)技術(shù)9.4分子標(biāo)記的應(yīng)用領(lǐng)域9DNA分子標(biāo)記技術(shù)DNA分子標(biāo)記的定義

DNA分子標(biāo)記就是在同一物種不同個(gè)體間DNA序列上的差異，某一特定的差異可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)出來(lái)，測(cè)出來(lái)的特定差異就是特定的DNA分子標(biāo)記。利用不同的實(shí)驗(yàn)方法可以得到許許多多的DNA分子標(biāo)記，這些DNA分子標(biāo)記表明了這些個(gè)體間遺傳物質(zhì)上的差異。遺傳標(biāo)記的發(fā)展形態(tài)標(biāo)記→

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（染色體多態(tài)性）→

蛋白質(zhì)標(biāo)記（同工酶，分子標(biāo)記）→

DNA標(biāo)記（分子標(biāo)記）RFLP

分析

RFLP（restrictionfragmentlengthpoly-morphism）稱(chēng)為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。當(dāng)用某種限制性?xún)?nèi)切酶處理不同生物個(gè)體來(lái)源的DNA時(shí)，由于個(gè)體間DNA序列的差異，所產(chǎn)生的切割片段長(zhǎng)度和數(shù)量可能不同，利用凝膠電泳可以將這些片段分離并觀察到差異，這種差異就是RFLP。RFLP

分析

RFLP產(chǎn)生的差異帶可以作為分子標(biāo)記，用于遺傳學(xué)的研究。當(dāng)一個(gè)生物有多條染色體，且DNA分子很大時(shí)，用一種限制性?xún)?nèi)切酶切割出的DNA片段太多，電泳后的條帶無(wú)法分辨。

使用某一特定序列的標(biāo)記探針，與電泳分離的片段進(jìn)行Southern雜交，再顯示出雜交帶，可以大大減少被觀察條帶的數(shù)目，便于不同生物個(gè)體間的比較和找出差異帶。RFLP

分析

換不同的限制性?xún)?nèi)切酶切割，配合不同的標(biāo)記探針，可以得到數(shù)目多得驚人的條帶，從而找到很多的分子標(biāo)記。這些分子標(biāo)記與表型標(biāo)記一樣，可以用于遺傳學(xué)的研究。但分子標(biāo)記沒(méi)有顯隱性之分，都是共顯性的。采用一種探針

作6

個(gè)栽培品種的RFLP分析RFLP所用探針的來(lái)源

RFLP分析的效率依賴(lài)于選擇合適的探針。由于用能探測(cè)重復(fù)序列的探針探測(cè)出的片段太多，難以比較，所以探針一般來(lái)自單拷貝或低重復(fù)序列。常用的RFLP探針主要來(lái)源于隨機(jī)基因組克隆和cDNA克隆。RFLP所用探針的來(lái)源

由于基因組DNA中甲基化一般很少在表達(dá)基因中發(fā)生，故用對(duì)甲基化敏感的限制酶切，可得到長(zhǎng)度為1～2kb的DNA片段，它們是單拷貝或低重復(fù)序列，用這些片段制成文庫(kù)，即可用作RFLP探針。

如果用cDNA克隆作探針，最好制備來(lái)自生物整體mRNA的cDNA文庫(kù)。RFLP標(biāo)記的共顯性什么是多態(tài)性

多態(tài)性是在不同個(gè)體之間比較得到的差異帶，來(lái)自于一個(gè)個(gè)體本身的長(zhǎng)短不等的片段不是多態(tài)性。RFLP標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)1.RFLP標(biāo)記無(wú)表型效應(yīng)，不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響。因此可在特征性狀遠(yuǎn)未出現(xiàn)之前就可以知道其基因型。2.

RFLP標(biāo)記在等位之間是共顯性的，因此不受雜交方式的影響。不管是正交、反交、回交，總是在F1代中含有兩親本各一組染色體的片段之和。3.用不同探針可以探測(cè)出不同的RFLP標(biāo)記，標(biāo)記的密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)以性狀為基礎(chǔ)的圖譜。RFLP

的不足

雖然RFLP分子標(biāo)記有這些優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)驗(yàn)步驟較多，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，費(fèi)用也高，使其應(yīng)用受到一定的限制。

要使RFLP在指導(dǎo)遺傳育種中發(fā)揮作用，還必須將RFLP與已知性狀聯(lián)系起來(lái)，僅有RFLP標(biāo)記圖使用價(jià)值不大。可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)（VNTRs）

在真核生物基因組中有小衛(wèi)星和微衛(wèi)星序列存在，它們是短序列（核心序列）高度重復(fù)的序列，在不同生物個(gè)體間，某一座位上的核心序列重復(fù)的次數(shù)有很大差異，并且這些重復(fù)序列有多座位性，因此形成了高度的多態(tài)性。用某種高度重復(fù)序列的核心序列作探針，測(cè)定其RFLP，得到電泳后的雜交圖譜，這種圖譜稱(chēng)為指紋圖譜，可以用來(lái)鑒別個(gè)體、親子鑒定等。VNTR一例Thecauseofthevariationbetweenindividualgenomesatmicrosatellitesorminisatellitesisthatindividualalleleshavedifferentnumbersoftherepeatingunit.Forexample,oneminisatellitehasarepeatlengthof64bp,andisfoundinthepopulationwiththefollowingdistribution:

7%18repeats11%16repeats43%14repeats

36%13repeats4%10repeatsVNTR差異帶的檢測(cè)父母子女間VNTR的檢測(cè)結(jié)果VNTR應(yīng)用舉例

用33.15（探針名）進(jìn)行白種人的DNA指紋分析時(shí)，兩個(gè)無(wú)血緣關(guān)系的個(gè)體具有相同DNA指紋圖譜的概率為3×10－11，而當(dāng)把33.15和33.6兩個(gè)探針取得的結(jié)果綜合分析時(shí)，兩個(gè)個(gè)體指紋圖譜相同的概率更是降低到5×10－19。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD）

RAPD（randomlyamplifiedpolymorphicDNA）稱(chēng)為隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性。它是利用隨機(jī)引物（通常為10個(gè)核苷酸）對(duì)不同生物個(gè)體基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，溴化乙錠染色，顯示出擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。不同個(gè)體間差異的條帶可以作為分子標(biāo)記。兩個(gè)不同油菜品系的RAPDRAPD的特點(diǎn)雖然對(duì)具體的一個(gè)引物而言其檢測(cè)DNA多態(tài)性的位點(diǎn)是有限的，但是當(dāng)采用一組引物時(shí)，檢測(cè)區(qū)域幾乎可以覆蓋整個(gè)基因組，從而得到整個(gè)基因組DNA的多態(tài)性。RAPD的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便迅速，不需要標(biāo)記探針。只要有一套隨機(jī)引物就能對(duì)任何物種進(jìn)行RAPD操作。RAPD標(biāo)記也必須與表型相聯(lián)系才能發(fā)揮指導(dǎo)遺傳育種的作用。MAAP技術(shù)比較

DAFAP-PCRRAPD引物長(zhǎng)度(nt)5～1520～349～10引物濃度(mmol/L)3～3030.3典型擴(kuò)增產(chǎn)物條帶

10～1003～501～10分辨率

高

中等

低分離膠

聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺

瓊脂糖顯色

銀染

放射性標(biāo)記

溴化乙錠染色嚴(yán)謹(jǐn)度

低或高

低和高

低(Multiplearbitraryampliconprofiling)DAF：DNAamplificationfingerprinting

AP-PCR：arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction

MAAP結(jié)果比較AFLP

AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymor-phism,擴(kuò)增酶切片段多態(tài)性）又稱(chēng)為SAP（Specificamplifiedpolymorphism,專(zhuān)一擴(kuò)增多態(tài)性），它結(jié)合了RFLP和PCR二者的優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過(guò)酶切和用特異引物擴(kuò)增，檢測(cè)DNA的多態(tài)性。由于退火溫度高，結(jié)果重復(fù)性好，具有RAPD無(wú)法比擬的優(yōu)越性。它是一種高效的分子標(biāo)記，可用來(lái)構(gòu)建高密度的遺傳圖譜。

AFLP

指紋技術(shù)

先用兩種限制性?xún)?nèi)切酶（A和B）對(duì)基因組DNA切割，得到兩個(gè)粘性末端為A－A、A－B、B－B三種片段。將A和B兩種接頭加到這些片段的兩端，再用相應(yīng)的A和B引物對(duì)這些片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只有A－B片段可以被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用電泳檢測(cè)其多態(tài)性。通過(guò)換用不同的限制酶及不同的引物，可以控制擴(kuò)增條帶的數(shù)目，檢測(cè)不同的分子標(biāo)記。圖9－5AFLP指紋技術(shù)用于AFLP的人工接頭

和引物舉例

EcoRⅠ適配器：

CORE

ENZ

↓

5’-CTCGTAGACTGCGTACC

--GAATTC--

CAT

CTGACGCAT

GGTTAA-5’

--CTTAAG--

↑EcoRⅠ端

引物：

CORE

ENZ

EXT

5’-GACTGCGTACCAATTCNNN↑用于AFLP的人工接頭

和引物舉例

MseⅠ適配器：

CORE

ENZ

↓

5’-GACGATGAGTCCTGAG--TTAA--

TACTCAGGACTCAT-5’--AATT--

↑

MseⅠ端引物：

CORE

ENZ

EXT

5’-GATGAGTCCTGAGTAANNNAFLP對(duì)酶切位點(diǎn)的要求

AFLP一般采用雙酶切，一個(gè)酶切點(diǎn)多（識(shí)別4堿基），另一個(gè)酶切點(diǎn)少（識(shí)別6堿基）。切點(diǎn)多的酶產(chǎn)生較小的片段，切點(diǎn)少的酶能夠減少可擴(kuò)增片段的數(shù)目。這兩種酶都必須產(chǎn)生粘性末端。如果用EcoRⅠ（識(shí)別6堿基）和MseⅠ（識(shí)別4堿基）組合，則產(chǎn)生的酶切片段有三種：即MseⅠ/MseⅠ、EcoRⅠ/MseⅠ、EcoRⅠ/EcoRⅠ。如果按酶切位點(diǎn)隨機(jī)分布來(lái)算（256，4096），MseⅠ/MseⅠ片段占90%以上，EcoRⅠ/MseⅠ片段為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)數(shù)的兩倍，而EcoRⅠ/EcoRⅠ幾乎沒(méi)有。AFLP對(duì)引物的要求

引物分為三個(gè)部分，分別為CORE、ENZ、EXT，其中CORE與人工接頭中的CORE互補(bǔ)，ENZ與粘性末端序列互補(bǔ)，EXT為選擇性堿基。引物一般16到25個(gè)堿基，引物3’端的選擇性堿基每增加1個(gè)，譜帶數(shù)減少。而選擇性堿基GC含量越高，產(chǎn)生的譜帶數(shù)越少，所以通過(guò)調(diào)整選擇性堿基的數(shù)目和種類(lèi)，就能靈活地調(diào)節(jié)擴(kuò)增譜帶數(shù)。隨著選擇性堿基的增加，引物與模板的錯(cuò)配率也相應(yīng)增加，為了控制錯(cuò)配率，選擇性堿基一般為1～3個(gè)。AFLP的PCR擴(kuò)增

對(duì)于較復(fù)雜的基因組來(lái)說(shuō)，AFLP的PCR擴(kuò)增可分兩步進(jìn)行，第一步預(yù)擴(kuò)增一般采用2種只帶1個(gè)選擇性堿基的引物，引物不被標(biāo)記，擴(kuò)增后稀釋10倍，取少量作為第二次擴(kuò)增的模板，這樣既為第二步擴(kuò)增提供了充足的模板，又對(duì)模板起到了選擇性純化的作用，第二次擴(kuò)增采用帶有2～3個(gè)選擇性堿基的引物，引物被標(biāo)記，這樣可以提高擴(kuò)增的特異性。用EcoRI和MseI引物只擴(kuò)增EcoRI-MseI片段ⅠⅡⅢⅣABCABCABCABC引物組合Ⅰ：EcoRI+C/MseI+ACⅡ：EcoRI+C/MseI+CAⅢ：EcoRI+T/MseI+AGⅣ：EcoRI+T/MseI+ATA：標(biāo)記EcoRI引物B：標(biāo)記MseI引物C：標(biāo)記MseI引物，但不加

EcoRI引物只擴(kuò)增EcoRI-MseI片段的原因(i)TheMseIprimerhasalowerannealingtemperaturethantheEcoRIprimer,makingamplificationofMseI-MseIfragmentslessefficientcomparedwithEcoRI-MseIfragmentsundertheconditionsused.WehaveindeedobservedstrongeramplificationofMseI-MseIfragmentsusinglongeroralternativeMseIprimersandadapters.只擴(kuò)增EcoRI-MseI片段的原因(ii)TheMseI-MseIfragmentshaveaninvertedrepeatattheends,duetothefactthattheyareamplifiedbyasingleprimer.Therefore,astem-loopstructuremaybeformedbybase-pairingoftheendsofthefragments.whichwillcompetewithprimerannealing.ThisisalsoconfirmedbytheobservationthatonlylargerfragmentswereamplifiedinAFLPreactionswhenonlytheMseIprimerwasadded.Formationofastem-loopstructurewillbemoredifficultintheselargerfragments.引物5’端以G開(kāi)頭的原因AnimportantfeatureoftheAFLPprimersisthatallprimersstartwitha5’guanine(G)residue.Wehavefoundthata5’G-residueintheunlabeledprimeriscrucialtopreventthephenomenonofdoublebands.Thedoublebandsappearedtoresultfromincompleteadditionofanextranucleotidetothesynthesizedstrands.ThisterminaltransferaseactivityoftheTaqpolymeraseisquitestrong.

Weconcludefromourresultsthatthisterminaltransferaseactivityismoststrong(almost100%ofthesynthesizedstrands)whenthe3’nucleotideofthesynthesizedstrandisacytidine(C).

引物3’端選擇性堿基數(shù)目對(duì)擴(kuò)增特異性的影響ⅠⅡⅢABCDABCDABCD引物組合Ⅰ：EcoRI+A/MseI+CTCAⅡ：EcoRI+A/MseI+CTGCⅢ：EcoRI+T/MseI+CTCAA：MseI引物帶1個(gè)選擇性堿基B：MseI引物帶2個(gè)選擇性堿基C：MseI引物帶3個(gè)選擇性堿基D：MseI引物帶4個(gè)選擇性堿基序列標(biāo)志位點(diǎn)技術(shù)

序列標(biāo)志位點(diǎn)（sequencetagsites，STS）技術(shù)是一類(lèi)基于特定引物序列形成的，利用PCR技術(shù)進(jìn)行的分子標(biāo)記技術(shù)。

SSR是序列標(biāo)志位點(diǎn)技術(shù)中的一種，它以某一微衛(wèi)星座位兩側(cè)的單一序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增這個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的序列，然后電泳檢測(cè)產(chǎn)物的大小。由于在不同生物個(gè)體中這個(gè)座位核心序列的重復(fù)次數(shù)可能不同，同一個(gè)體的兩條染色體的這個(gè)座位核心序列的重復(fù)次數(shù)也可能不同（雜合體），這個(gè)座位有許多不同長(zhǎng)度的等位“基因”（復(fù)等位“基因”）。SSR就是檢測(cè)不同個(gè)體間等位“基因”在長(zhǎng)度上的差異。圖9－6微衛(wèi)星序列長(zhǎng)度多態(tài)性測(cè)定圖9－7大豆ATT5SSR位點(diǎn)14個(gè)等位基因的大小單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)

SNP是指基因組內(nèi)DNA某一特定位置的核苷酸存在置換、插入、缺失等變化，而且其中最少有一種等位基因在群體中突變頻率不小于1%。SNP一般以替換為主，顛換與轉(zhuǎn)換之比為1:2。轉(zhuǎn)換（transition）：用另一種嘌呤堿基代替原有的嘌呤堿基，或用另一種嘧啶堿基代替原有的嘧啶堿基。顛換（transversion）：嘌呤堿基被嘧啶堿基所替代或嘧啶堿基被嘌呤堿基所替代。SNP的研究狀況

目前人類(lèi)基因組研究中SNP的研究最為廣泛。大多數(shù)SNP對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)直接的影響，因?yàn)榻^大多數(shù)的SNP位于非編碼區(qū)。目前已有的人類(lèi)基因組SNP圖譜中共有142萬(wàn)個(gè)SNP，但只有約4.23%的SNP位于外顯子內(nèi)。

除此，在果蠅、雞、犬類(lèi)、豬、綿羊、牛等動(dòng)物上也開(kāi)展了SNP研究。在植物中展開(kāi)SNP廣泛研究的種類(lèi)則較少，近幾年僅在玉米、大麥、小麥、番茄、水稻等農(nóng)作物上開(kāi)展了此項(xiàng)工作。

編碼區(qū)內(nèi)SNP的意義

在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩?lái)說(shuō)，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP（codingSNP，cSNP）比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周?chē)蛄械?/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。SNP的影響

從對(duì)生物的遺傳性狀的影響上來(lái)看，cSNP又可分為2種：

一種是同義cSNP（synonymouscSNP），即cSNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同。

另一種是非同義cSNP（non-synonymouscSNP），指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。SNP用作遺傳標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)

SNP用作遺傳標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計(jì)出來(lái)。（2）它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛得多。（3）與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)相比，SNP是高度穩(wěn)定的，尤其是處于編碼區(qū)的cSNP，而串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)的高突變率容易引起對(duì)人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。SNP用作遺傳標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)（4）部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會(huì)直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)。（5）易于進(jìn)行自動(dòng)化、規(guī)?；治?，縮短了研究時(shí)間。由于SNP的二態(tài)性，非此即彼，在基因組篩選中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的長(zhǎng)度，這就利于發(fā)展自動(dòng)化技術(shù)篩選或檢測(cè)SNPs。檢測(cè)單核苷酸差異的方法單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SingleStrandConformationPolymorphism，SSCP）

DNA片段雙鏈變性成單鏈后，在非變性條件下會(huì)折疊成不同的空間構(gòu)象，單鏈這種構(gòu)象會(huì)因個(gè)別核苷酸置換而改變，長(zhǎng)度相同或相近的單鏈在電泳時(shí)由于構(gòu)象不同而具不同遷移率，從而顯示出多態(tài)性。在SSCP分析時(shí)，應(yīng)先將擴(kuò)增后的DNA片段變性為單鏈，然后在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。檢測(cè)單核苷酸差異的方法基因芯片法

其基本原理是利用DNA分子的變性雜交特性，通過(guò)DNA芯片上的固定探針或樣品DNA與游離樣品DNA或探針雜交來(lái)推斷未知靶分子的序列，雜交發(fā)生與否可采用熒光標(biāo)記技術(shù)來(lái)檢測(cè)。由于該技術(shù)可將大量探針同時(shí)固定于支持物上，所以一次可以對(duì)大量DNA分子進(jìn)行檢測(cè)分析，解決了傳統(tǒng)印跡雜交技術(shù)復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測(cè)目的分子少、效率低的問(wèn)題。近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出，一次實(shí)驗(yàn)就可以同時(shí)分析成千個(gè)多態(tài)