生物化學(xué)14 DNA的生物合成

她們?yōu)楹稳绱讼嘞?？基因：編碼蛋白質(zhì)或RNA等具有特定功能產(chǎn)物的、負(fù)載遺傳信息的基本單位，通常是指染色體或基因組的一段DNA序列。復(fù)制翻譯

蛋白質(zhì)（病毒）RNA（病毒）逆轉(zhuǎn)錄中心法則（Thecentraldogma）:遺傳信息從DNA經(jīng)RNA流向蛋白質(zhì)的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄RNA翻譯蛋白質(zhì)DNA復(fù)制1958年Crick，1970年Temin復(fù)制(replication)是指使子代細(xì)胞得到和親代相一致的遺傳物質(zhì)，DNA復(fù)制是以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過(guò)程。復(fù)制親代DNA子代DNA第十四章DNA的生物合成DNABiosynthesis(Replication)【目的要求】一、掌握半保留復(fù)制的概念。二、掌握DNA復(fù)制的基本特征和過(guò)程。三、掌握DNA復(fù)制的原料、參與的因子和各種酶類。四、熟悉逆轉(zhuǎn)錄的概念及基本過(guò)程。執(zhí)考大綱要求的知識(shí)點(diǎn)中心法則（1）DNA生物合成的概念

（2）DNA的復(fù)制(參與體系和過(guò)程？)

（3）逆轉(zhuǎn)錄

（4）DNA的損傷與修復(fù)本章主要內(nèi)容：DNA復(fù)制的基本特征(重點(diǎn)掌握）

DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化(重點(diǎn)掌握）原核生物DNA復(fù)制過(guò)程(重點(diǎn)掌握）真核生物DNA生物合成過(guò)程逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式DNA復(fù)制的基本特征BasicRulesofDNAReplication第一節(jié)半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)DNA復(fù)制的主要特征一、DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制

DNA合成時(shí)，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板，按堿基配對(duì)規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。子代的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過(guò)來(lái)，另一股單鏈則完全從新合成。子代DNA和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的概念:AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA復(fù)制過(guò)程中形成的復(fù)制叉子代DNA子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式:

全保留式半保留式混合式——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代密度梯度實(shí)驗(yàn)

重氮DNA重氮DNA重氮DNA按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義:遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。原核生物基因組是環(huán)狀DNA，只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)（origin）。復(fù)制從起點(diǎn)開始，向兩個(gè)方向進(jìn)行解鏈，進(jìn)行的是單點(diǎn)起始雙向復(fù)制。二、DNA復(fù)制從起點(diǎn)向兩個(gè)方向延伸復(fù)制中的放射自顯影圖象A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)oriterABC真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子的復(fù)制。從一個(gè)DNA復(fù)制起點(diǎn)起始的DNA復(fù)制區(qū)稱為一個(gè)復(fù)制子(replicon)。復(fù)制子是獨(dú)立完成復(fù)制的功能單位。5’3’oriorioriori5’3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制3’3535解鏈方向3′5′3′3′5′領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)

順解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制為連續(xù)進(jìn)行，稱為領(lǐng)頭鏈。

另一股鏈復(fù)制方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長(zhǎng)，稱為隨從鏈。

復(fù)制中不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。

領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。三、半不連續(xù)復(fù)制DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化第二節(jié)TheEnzymologyandTopologyofDNAReplication參與DNA復(fù)制的物質(zhì):底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡(jiǎn)寫為DNA-pol；模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈；引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白質(zhì)因子。復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)是生成磷酸二酯鍵(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi聚合反應(yīng)的特點(diǎn):DNA新鏈生成需RNA引物和模板；新鏈的延長(zhǎng)只可沿5→3方向進(jìn)行。一、DNA聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡(jiǎn)稱：DNA-pol活性：1.53

的聚合活性2.核酸外切酶活性5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′35外切酶活性:53外切酶活性:?能切除突變的DNA片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解。核酸外切酶活性:（一）原核生物有3種DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ原核生物的DNA聚合酶２個(gè)核心酶1個(gè)-復(fù)合物（、、、、、

6種亞基）1對(duì)-亞基（可滑動(dòng)的DNA夾子）DNA聚合酶Ⅲ全酶結(jié)構(gòu)全酶結(jié)構(gòu)包括：功能：DNA-polⅠ（109kD）對(duì)復(fù)制中的錯(cuò)誤進(jìn)行校讀，對(duì)復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，只能延長(zhǎng)約20個(gè)核苷酸。323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

DNA-polⅡ（120kD）DNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。DNA-polⅡ?qū)δ０宓奶禺愋圆桓?，即使在已發(fā)生損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此認(rèn)為，它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。（二）常見的真核細(xì)胞DNA聚合酶有5種二、DNA聚合酶的堿基選擇和校對(duì)功能實(shí)現(xiàn)復(fù)制的保真性復(fù)制按照堿基配對(duì)規(guī)律進(jìn)行，是遺傳信息能準(zhǔn)確傳代的基本原理。此外還需酶學(xué)的機(jī)制來(lái)保證復(fù)制的保真性。遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能；復(fù)制出錯(cuò)時(shí)有即時(shí)校對(duì)功能。DNA復(fù)制的保真性至少要依賴三種機(jī)制：

1.嚴(yán)格遵守堿基配對(duì)規(guī)律；DNA聚合酶的高度專一性（嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則，但錯(cuò)配率為710-6）復(fù)制保真性的酶學(xué)機(jī)制：2、DNA-pol的核酸外切酶活性和及時(shí)校讀（二）復(fù)制的保真性依賴DNA-pol對(duì)堿基的正確選擇DNApolIII在催化磷酸二酯鍵形成之前完成對(duì)堿基的選擇。3、復(fù)制的保真性依賴DNA-pol對(duì)堿基的正確選擇三、復(fù)制中的解鏈伴有DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化DNA分子的堿基埋在雙螺旋內(nèi)部，只有把DNA解成單鏈，它才能起模板作用。

（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)1、解旋酶(helicase)功能:斷裂互補(bǔ)堿基間的氫鍵，使DNA雙鏈分離成單鏈。解螺旋酶ATP解旋酶Rep蛋白，DnaB功能:利用ATP供能，把雙鏈DNA解開成單鏈。DNA正超螺旋與負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋正超螺旋DNA雙螺旋拓?fù)洚悩?gòu)酶改變DNA超螺旋狀態(tài)、理順DNA鏈2、拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase，Topo)解鏈過(guò)程中正超螺旋的形成

切割DNA雙鏈，此時(shí)不需ATP；爾后由ATP供能，使DNA分子成負(fù)超螺旋再連接切口。不需ATP，切割雙鏈DNA中的一鏈，使DNA松弛后,連接切口。TopoⅠ:TopoⅡ:

臨床上使用的某些抗腫瘤藥（如喜樹堿，鬼臼乙叉甙等）是通過(guò)抑制Topo酶活性而殺死腫瘤細(xì)胞的。22/62Topo酶：切割DNA鏈，使其松弛后再連接。動(dòng)畫3、單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)

功能：穩(wěn)定已經(jīng)解開的單鏈，防止核酸酶的水解。

DNA結(jié)合蛋白由177個(gè)氨基酸構(gòu)成的四聚體蛋白5′

5′RNA引物5′3′5′3′4、引物酶(primase)DNA合成需在RNA引物的基礎(chǔ)上進(jìn)行催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一種特殊的RNA聚合酶？依賴DNA的RNA聚合酶對(duì)利福平不敏感HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’5、DNA連接酶連接復(fù)制中的單鏈缺口DNA連接酶的作用：DNA連接酶在復(fù)制中起最后接合缺口的作用。在DNA修復(fù)、重組及剪接中也起縫合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：參與DNA復(fù)制的物質(zhì)各有什么作用呀？原核生物DNA復(fù)制過(guò)程TheProcessofDNAReplicationinProkaryotes第三節(jié)起始是復(fù)制中較為復(fù)雜的環(huán)節(jié)，在此過(guò)程中，各種酶和蛋白因子在復(fù)制起始點(diǎn)處裝配引發(fā)體，形成復(fù)制叉并合成RNA引物。

需要解決兩個(gè)問(wèn)題：1.DNA解開成單鏈，提供模板。2.形成引發(fā)體，合成引物，提供3-OH末端。一、復(fù)制的起始E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC

GATTNTTTATTT

···GATCTNTTNTATT

···GATCTCTTATTAG

···11317293244···

TGTGGATTA

-‖-

TTATACACA

-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串聯(lián)重復(fù)序列

反向重復(fù)序列5353（一）

DNA的解鏈A--TA--GTGTTTATACACATTATCCACAAATAGGT--T回文結(jié)構(gòu)AGCT

TCGAE.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC跨度為245bp原核生物的復(fù)制起始部位及解鏈

DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3535（二）引物合成和引發(fā)體形成含有解螺旋酶（DnaB蛋白）、DnaC蛋白、引物酶（DnaG蛋白）和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。功能：解開成單鏈，生成引物。引發(fā)體3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。引物3'HO5'引物酶引發(fā)體和復(fù)制叉的生成

二、DNA鏈的延長(zhǎng)復(fù)制的延長(zhǎng)指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長(zhǎng)中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol領(lǐng)頭鏈的合成：領(lǐng)頭鏈的子鏈沿著5→3方向可以連續(xù)地延長(zhǎng)。后隨鏈的合成

在復(fù)制叉同時(shí)合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈復(fù)制過(guò)程簡(jiǎn)圖原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500三、復(fù)制的終止555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA連接酶

子鏈中的RNA引物被取代真核生物DNA生物合成過(guò)程TheProcessofDNABiosynthesisineukaryotes第四節(jié)(自學(xué)為主)真核生物復(fù)制子多、岡崎片段短、復(fù)制叉前進(jìn)速度慢等；DNA復(fù)制從引發(fā)進(jìn)入延伸階段發(fā)生DNA聚合酶/轉(zhuǎn)換；切除岡崎片段RNA引物的是核酸酶RNAseHⅠ和FEN1等。真核生物與原核生物DNA復(fù)制的差異：哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM細(xì)胞能否分裂，決定于進(jìn)入S期及M期這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。G1→S及G2→M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。蛋白激酶通過(guò)磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實(shí)施調(diào)控作用。真核生物每個(gè)染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(replicationfactor,RF)。一、真核生物復(fù)制的起始與原核基本相似增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）在復(fù)制起始和延長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用。具有與E.coliDNA聚合酶Ⅲ的β亞基相同的功能和相似的構(gòu)象。DNA-polδ和polα分別兼有解螺旋酶和引物酶活性。在復(fù)制叉及引物生成后，DNA-polδ通過(guò)PCNA的協(xié)同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3-OH基礎(chǔ)上連續(xù)合成領(lǐng)頭鏈。隨從鏈引物也由polα催化合成。然后由PCNA協(xié)同，polδ置換polα，繼續(xù)合成DNA子鏈。二、真核生物復(fù)制的延長(zhǎng)發(fā)生DNA聚合酶α/δ轉(zhuǎn)換3553領(lǐng)頭鏈3535親代DNA后隨鏈引物核小體三、真核生物DNA合成后立即組裝成核小體染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。四、端粒酶參與解決染色體末端復(fù)制問(wèn)題端粒酶：由RNA與蛋白質(zhì)組成，具逆轉(zhuǎn)錄酶活 性，以自身RNA為模板合成端粒DNA。（TTAGGG）n末端DNA序列：端粒（Telomere）：是真核生物染色體線性DNA分子末端的一種特殊結(jié)構(gòu)。53355335+5333355端粒酶催化作用的爬行模型真核所有染色體DNA復(fù)制僅僅出現(xiàn)在細(xì)胞周期的S期，而且只能復(fù)制一次。五、真核生物染色體DNA在每個(gè)細(xì)胞周期中只能復(fù)制一次逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第五節(jié)雙鏈