酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)介紹

酵母雙雜交系統(tǒng)

技術(shù)介紹

05February2023寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司主要內(nèi)容背景介紹:關(guān)注蛋白質(zhì)背景介紹:為什么要研究蛋白互作？背景介紹:Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)的功能背景介紹:Clontech分子生物學(xué)工具ClontechMatchmaker?背景介紹:MatchmakerGold系統(tǒng)背景介紹:Matchmaker

Gold系統(tǒng)原理ReporterGeneReporterGeneReporterGene主要內(nèi)容基本原理:酵母雙雜交參考文獻(xiàn)Nature.1989Jul20;340(6230):245-6.Anovelgeneticsystemtodetectprotein-proteininteractions.FieldsS,SongO.DepartmentofMicrobiology,StateUniversityofNewYorkatStonyBrook,StonyBrook11794.63000次引用基本原理:GAL4轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)ADDNA-BDGAL4蛋白具有兩個功能結(jié)構(gòu)域BD結(jié)合結(jié)構(gòu)域AD激活結(jié)構(gòu)域基本原理:GAL4轉(zhuǎn)錄因子的分子機(jī)理在GAL4based雙雜交系統(tǒng)中:正常情況在酵母細(xì)胞內(nèi):PromotergalmetabolicgeneGALUASTranscriptionADBDReporterGeneGAL4AD基本原理:三個啟動子，四個報告基因獲得陽性克隆子報告基因表達(dá)AbA抗性篩選Ade營養(yǎng)篩選His營養(yǎng)篩選X-a-gal藍(lán)白篩選M1G1G2降低假陽性！主要內(nèi)容ClontechMM系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)SMART方法與同源重組技術(shù)結(jié)合構(gòu)建文庫，聰明的酵母自己做克隆。AbA抗性篩選的添加，有效抑制背景生長，大大降低假陽性。文庫構(gòu)建于型酵母菌株α型Y187中，方便后續(xù)與a型菌株Y2HGold進(jìn)行mating直接篩選。ClontechMM系統(tǒng):蛋白互作基本流程驗(yàn)證蛋白互作自己構(gòu)建文庫：630490預(yù)制細(xì)菌文庫：638802（傳統(tǒng)型）預(yù)制酵母菌文庫：630480（均一化，通用型）

Clontech蛋白互作相關(guān)試劑盒文庫篩選文庫構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)：630489酵母菌轉(zhuǎn)化試劑盒：630439酵母培養(yǎng)基（套裝）：630495插入片段檢測：630497酵母質(zhì)粒提?。?30467體內(nèi)驗(yàn)證：630489630305體外Co-IP驗(yàn)證：630458630459631723631604文庫構(gòu)建:ClontechMM文庫構(gòu)建方法SMART合成cDNA共轉(zhuǎn)化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫分裝，凍存1mlmatingAAAAAAAAATTTTTTTTCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGCCCAAAAAAAAATTTTTTTTGGGLD-PCRCCCAAAAAAAATTTTTTTTGGGSMART合成cDNA共轉(zhuǎn)化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫分裝，凍存1mlmating聰明的酵母自己做克隆SD/Leu-Y187同源重組SMARTcDNA兩小時構(gòu)建文庫文庫構(gòu)建:ClontechMM文庫構(gòu)建方法SMART合成cDNA共轉(zhuǎn)化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫分裝，凍存1mlmatingSD/Leu-文庫構(gòu)建:ClontechMM文庫構(gòu)建方法文庫構(gòu)建:ClontechMM自制文庫篩選SMART合成cDNA共轉(zhuǎn)化，涂板

培養(yǎng)，收集菌液

文庫分裝，凍存1mlmatingY187，AD文庫Y2HGold，BD誘餌培養(yǎng)液DDO/X/A混合QDO/X/A文庫篩選:ClontechMM文庫篩選630489Matchmaker?GoldYeastTwo-HybridSystem兩個載體兩個菌株轉(zhuǎn)化試劑盒control630489Y187Y2HGold三個載體陽性對照，陰性對照。BDvector：pGBKT7ADvector:pGADT7630439極大提高轉(zhuǎn)化率可以單獨(dú)購買文庫篩選:ClontechMM系統(tǒng)質(zhì)粒誘餌載體InY2HGold文庫篩選:誘餌載體構(gòu)建及其自激活檢測Y2HGold誘餌載體文庫篩選:Mating方法篩選Y187α型DDO篩選二倍體Y2HGolda

型Mating接合反應(yīng)

酵母的有性生殖過程，Clontech利用這個過程，實(shí)現(xiàn)了文庫篩選。

ADBDMixMatingQDO篩選文庫篩選:均一化通用文庫篩選均一化通用型文庫高豐度與低豐度均衡大大降低工作量大大降低假陽性更高的基因代表性NormalizedUniversalPre.libraryY187，AD文庫Y2HGold，BD誘餌培養(yǎng)液DDO/X/A混合QDO/X/A文庫篩選:傳統(tǒng)細(xì)菌文庫篩選文庫培養(yǎng)提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌取1ml菌液按照一定比例用LB稀釋，150ul/板進(jìn)行涂板，過夜培養(yǎng)。將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y187，獲得酵母文庫。Mating篩選將文庫與誘餌培養(yǎng)液混合，進(jìn)行Mating。涂篩選板，挑取陽性克隆子。刮取平板上的菌落，提取質(zhì)粒。文庫篩選:驗(yàn)證陽性克隆子（PCR確認(rèn)）25ul2×mix30PCRcycles25ulH2O630497Matchmaker?InsertCheckPCRMix2文庫篩選:酵母質(zhì)粒提取630467EasyyeastPlasmidIsolationKit驗(yàn)證互作:體內(nèi)驗(yàn)證SEAP630305MammalianMatchmakerTwo-HybridAssayKit2驗(yàn)證互作:體外Co-IP驗(yàn)證BaitAcGFP1PLPreyProteinA/GAgarosebeadsMatchmakerChemiluminescentCo-IPVectorSet（630458）MatchmakerChemiluminescentCo-IPKit（630459）ProlabelChemiluminescentDetectionKit（631723）

驗(yàn)證互作:體外Co-IP驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)流程PL檢測驗(yàn)證互作:FRET分析632466pDsRed-Monomer-C1Vector632470pAcGFP1-C1-VectorClontechMatchmaker系統(tǒng)產(chǎn)品選擇指南TheFRIGIDAComplexActivatesTranscriptionofFLC,aStrongFloweringRepressorinArabidopsis,byRecruitingChromatinModificationFactorsKChoi,JKim,HJHwang,SKim…-ThePlantCell…,2011-AmSocPlantBiolExtracellularsignal-regulatedkinase8(Erk8)controlsestrogen-relatedreceptorα(ERRα)cellularlocalizationandinhibitsitstranscriptionalactivityMRossi,DColecchia,CIavarone,AStrambi…-JournalofBiological…,2011–ASBMBWSB-1,anovelIL-21receptorbindingmolecule,enhancesthematurationofIL-21receptorHNara,TOnoda,MRahman,AAraki…-Cellular…,2011–ElsevierFHL1interactswithoestrogenreceptorsandregulatesbreastcancercellgrowthLDing,CNiu,YZheng,ZXiong…-JournalofCellular…,2011-WileyOnlineLibraryRab4interactswiththehumanP‐glycoproteinandmodulatesitssurfaceexpressioninmultidrugresistantK562cellsCFerrándiz‐Huertas…-…JournalofCancer,2011-WileyOnlineLibrary6.DuplicatedC-classMADS-boxgenesrevealdistinctrolesingynostemiumdevelopmentinCymbidiumensifolium(Orchidaceae)SYWang,PFLee,YILee,YYHsiao…-PlantandCell…,2011-JpnSocPlantPhysiolProteinInteractionDomainMappingofHumanKinetochoreProteinBlinkinRevealsaConsensusMotifforBindingofSpindleAssemblyCheckpointProteinsBub1andBubR1

TKiyomitsu,HMurakami…-MolecularandCellular…,2011-AmSocMicrobiol

ClontechMatchmaker系統(tǒng)近期參考文獻(xiàn)主要內(nèi)容常見問題分析:酵母雙雜交文庫如何獲得？購買Clontech公司預(yù)制文庫用630490自己構(gòu)建文庫請Takara公司提供文庫構(gòu)建服務(wù)如何獲得酵母雙雜交文庫常見問題分析:一定要做自激活檢測嗎？必須滴！自激活檢測必須做：1.需要在Y2HGold菌株中進(jìn)行。2.如果出現(xiàn)自激活現(xiàn)象需要調(diào)整AbA濃度或者調(diào)整序列。3.如果菌落生長過慢，可能是表達(dá)有毒性，需要用低拷貝質(zhì)粒pGBT9(630490提供)。常見問題分析:誘餌的大小有限制嗎？我們有文獻(xiàn)報道的8-750個氨基酸都有成功的案例。Heery,D.M.etal.(1997)Nature387(6634):733–736.2.SchaeferB.C.,Ed.(1997)GeneCl