微生物細(xì)胞破碎2-4

2023/2/5生物分離過(guò)程的一般流程本節(jié)內(nèi)容2023/2/5微生物細(xì)胞破碎celldisruption第一節(jié)細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu)第二節(jié)常用破碎方法第三節(jié)破碎率測(cè)定第四節(jié)包涵體的純化方法2023/2/5知識(shí)點(diǎn)：細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)，微生物細(xì)胞的破碎技術(shù)，破碎率的測(cè)定。重點(diǎn)：工業(yè)生產(chǎn)中常用的幾種細(xì)胞破碎方法的原理，操作過(guò)程常用設(shè)備，并能就實(shí)際生產(chǎn)情況予以合理的選擇。難點(diǎn)：常用破碎方法的合理選用。2023/2/5概述(目的和意義)細(xì)胞破碎（cellrupture）是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)包括目的產(chǎn)物成分釋放出來(lái)的技術(shù)。細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。為了研究細(xì)胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各種微生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)。2023/2/5第一節(jié)細(xì)胞壁的組成與結(jié)構(gòu)不同細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度不同，細(xì)胞破碎的難易程度也就不同。2023/2/51、細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由肽聚糖、胞壁酸、蛋白質(zhì)、脂多糖等組成；相鄰聚糖鏈上的短肽又交叉相聯(lián)，構(gòu)成了細(xì)胞壁的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細(xì)胞周圍。2023/2/5破碎細(xì)菌的主要阻力是來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和交聯(lián)的程度。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽(yáng)性菌有很大不同。

革蘭氏陰性菌典型的生物是大腸桿菌，通過(guò)這種細(xì)胞生產(chǎn)了很多細(xì)胞重組的產(chǎn)物。藥物名稱宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長(zhǎng)激素大腸桿菌治療侏儒病α-干擾素大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病等2023/2/5

2、酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀；中間一層是糖蛋白；最外層是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖-酶的復(fù)合物；破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。2023/2/53、真菌細(xì)胞壁真菌的細(xì)胞壁較厚，主要由多糖組成，其次還含有較少量的蛋白質(zhì)和脂類。不同的真菌，細(xì)胞壁的組成有很大的不同，其中大多數(shù)真菌的多糖壁是由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成，少數(shù)含纖維素。與酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁一樣，真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強(qiáng)度有所提高。2023/2/5紅面包霉菌細(xì)胞壁具有同心圓層狀結(jié)構(gòu)主要存在三種聚合物最外層(a)是α-和β-葡聚糖的混合物，第2層(b)是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)第3層(c)主要是蛋白質(zhì)，最內(nèi)層(d)主要是幾丁質(zhì)。紅面包霉菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖4、植物細(xì)胞壁構(gòu)架物質(zhì)：纖維素基質(zhì)：果膠典型結(jié)構(gòu)：胞間層初生壁次生壁2023/2/5微生物革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏陰性細(xì)菌酵母菌真菌壁厚20-80nm10-13nm100-300nm100-250nm主要組成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白質(zhì)(6-8%)脂類(8.5-13.5%)多聚糖(80-90%)脂類蛋白質(zhì)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)2023/2/5第二節(jié)細(xì)胞破碎技術(shù)2023/2/5機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法

物理破碎溫差破碎法壓差破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑表面活性劑酸堿酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞細(xì)胞破碎方法及其原理2023/2/5一、機(jī)械法高壓勻漿破碎法（homogenization）珠磨破碎法（beadgrinding）超聲波破碎法（ultrasonication）2023/2/5采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成）1、高壓勻漿法（High-pressurehomogenization）細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。高速剪切、碰撞及壓力驟降，造成細(xì)胞破碎。2023/2/5高壓勻漿器的種類高壓勻漿器的種類較多：WAB公司的AVPGaulin31MR型Branandluebbe

公司SHL40型意大利Niro

Soavi高壓勻漿機(jī)2023/2/5高壓勻漿法使用時(shí)注意事項(xiàng)高壓勻漿器的操作溫度上升約２-３℃/10MPa為了控制溫度的升高，可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在20℃左右?？梢圆捎脝未瓮ㄟ^(guò)勻漿器或多次循環(huán)通過(guò)等方式。2023/2/5高壓勻漿法適用的范圍（大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法）☆適用范圍

酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎；料液細(xì)胞濃度可以很高，20%左右?！畈灰耸褂靡自斐啥氯膱F(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽(yáng)性菌，含有包含體的基因工程菌（因包含體堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥）2023/2/5壓力壓力增加可減少細(xì)胞的循環(huán)次數(shù)，最好一次通過(guò)就可完全的破碎。但p大到一定值時(shí)對(duì)勻漿器的磨損增加。工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為55－70Mpa。菌體種類和生長(zhǎng)環(huán)境大腸桿菌的細(xì)胞比酵母細(xì)胞容易破碎生長(zhǎng)在簡(jiǎn)單的合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌比生長(zhǎng)在復(fù)雜培養(yǎng)基上容易破碎。影響高壓勻漿器細(xì)胞破碎因素2023/2/52）珠磨法beadmill細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。WSK臥式高效全能珠磨機(jī)2023/2/53）超聲波破碎（Ultrasonication)利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz超聲波處理細(xì)胞懸浮液。在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用,液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力,引起的粘滯性旋渦在細(xì)胞上造成了剪切力，使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破碎。2023/2/5JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種類型，一般破碎效果后者比前者好。破碎效率與細(xì)胞種類、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。操作過(guò)程產(chǎn)生大量的熱，操作需在冰水或外部冷卻的容器中進(jìn)行。2023/2/5適用范圍桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差。超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活。超聲波破碎的有效能量利用率極低。由于對(duì)冷卻的要求相當(dāng)苛刻，且大規(guī)模操作中聲能傳遞和散熱有困難，不易放大，但在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。2023/2/5技術(shù)原理效果成本舉例勻漿法(孔型)須使細(xì)胞通過(guò)的小孔，使細(xì)胞受到剪切力而破碎劇烈適中細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理超聲波法用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎適中昂貴細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理研磨法細(xì)胞被研磨物磨碎適中便宜不同機(jī)械破碎方法的比較2023/2/5二、非機(jī)械破碎方法酶溶破碎法（enzymelysis）化學(xué)破碎法（chemicaltreatment）滲透壓沖擊破碎法（osmoticshock）凍融破碎法（freezingandthawing）其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣。酶溶破碎法（enzymelysis）化學(xué)破碎法（chemicaltreatment）滲透壓沖擊破碎法（osmoticshock）凍融破碎法（freezingandthawing）其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣。酶溶破碎法（enzymelysis）化學(xué)破碎法（chemicaltreatment）滲透壓沖擊破碎法（osmoticshock）凍融破碎法（freezingandthawing）2023/2/51、酶解（酶溶法Enymaticlysis)

酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜。1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等2023/2/5外加酶法酶解法的特點(diǎn)是專一性強(qiáng)，必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成來(lái)選擇。溶菌酶（lysozyme)能專一性地分解細(xì)胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷鍵，主要用于細(xì)菌類細(xì)胞壁的裂解。2023/2/5放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽(yáng)性菌，以肽聚糖為主要成分，可采用溶菌酶。酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。2023/2/52)酶解-自溶作用

自溶作用是利用生物體自身產(chǎn)生的酶來(lái)溶胞，而不需外加其他的酶。改變其生長(zhǎng)環(huán)境，可以誘發(fā)產(chǎn)生過(guò)剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。缺點(diǎn)：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速度下降。2023/2/5酶解法的特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)發(fā)生酶解的條件溫和能選擇性地釋放產(chǎn)物胞內(nèi)核酸等泄出量少，細(xì)胞外形較完整缺點(diǎn)溶酶價(jià)格高溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶)產(chǎn)物抑制的存在

2023/2/5有選擇性的加入某些化學(xué)試劑，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇性地滲透出來(lái)。2、化學(xué)滲透法（Chemicalpermeation）取決于化學(xué)試劑類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。

常用化學(xué)試劑有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等2023/2/5酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/LHCl。堿能溶解細(xì)胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來(lái)。成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。（1）酸、堿處理法2023/2/5細(xì)胞破碎常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）非離子型如TritonX-100和吐溫（Tween）等（2）表面活性劑無(wú)論表面活性劑是陰離子、陽(yáng)離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與細(xì)胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解2023/2/5能分解細(xì)胞壁中的磷脂，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來(lái)。有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等。（3）有機(jī)溶劑（4）EDTA螯合劑處理G-細(xì)菌，對(duì)細(xì)胞壁外層有破壞作用。G-細(xì)菌的壁外層結(jié)構(gòu)通?？慷r(jià)陽(yáng)離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來(lái)維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。非極性R基氨基酸：甘氨酸、丙氨酸小分子氨基酸靜電引力可以滲透過(guò)細(xì)胞壁中，通過(guò)氫鍵、范德華力、靜電引力等化學(xué)親和力改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。（5）溫和化學(xué)滲透劑處理2023/2/5通用性差；時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過(guò)50%；有些化學(xué)試劑有毒；化學(xué)試劑的加入常會(huì)給隨后產(chǎn)物的純化帶來(lái)困難，并影響最終產(chǎn)物純度?；瘜W(xué)滲透法特點(diǎn)缺點(diǎn)對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過(guò)，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。優(yōu)點(diǎn)2023/2/53、物理法滲透壓沖擊法凍結(jié)-融化法干燥法2023/2/51）滲透壓沖擊法滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，將細(xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過(guò)程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。2023/2/52）凍結(jié)-融化法將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15℃），然后在室溫中融化，反復(fù)多次達(dá)到破壁作用；一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能；另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂；適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此外，在凍融過(guò)程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。

2023/2/5使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對(duì)干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來(lái)。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)3）干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥2023/2/52023/2/5三、選擇破碎方法的依據(jù)細(xì)胞壁強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)(高聚物交聯(lián)程度、種類和壁厚度)；細(xì)胞處理量；目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)破碎條件的敏感性；破碎程度；目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放。2023/2/5四、選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物的一般原則⑴僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置周圍當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞膜附近時(shí)，可采用較溫和的方法，如酶溶法、滲透壓沖擊法和凍結(jié)－融化法等。當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)時(shí)，則需采用強(qiáng)烈的機(jī)械破碎法．當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物處于與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合的狀態(tài)時(shí)，調(diào)節(jié)溶液pH值，離子強(qiáng)度或添加與目標(biāo)產(chǎn)物具有親和性的試劑如：螯合劑、表面活性劑等，使目標(biāo)產(chǎn)物容易溶解釋放。2023/2/5(2)機(jī)械破碎法和化學(xué)法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目標(biāo)產(chǎn)物釋放率條件下，降低細(xì)胞的破碎程度。2023/2/5

討論題：青霉素?；讣?xì)胞破碎的研究

一.化學(xué)法

20%(W/V)大腸桿菌懸浮液+B.A37℃攪拌高速離心

測(cè)上清液酶活。1.處理時(shí)間

R%

2.5h2.丁酯用量條件：37℃，攪拌3小時(shí)適宜的B.A加量為12%，釋放率R=40%12%55%R

%12%2.03U/mg比活2023/2/5二.化學(xué)法—凍融法結(jié)合

加B.A(12%,37℃攪拌3h）菌懸液凍融(凍結(jié)14h，

融化)釋放率—55%；比活—2.69u/mg

三.化學(xué)—超聲波振蕩法結(jié)合

先丁酯處理，再超聲波（90秒），釋放率72%，小型設(shè)備，不能工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。四.高壓勻漿法

20%(W/V)菌懸液，ΔP=50MPa，N=3。釋放率R=38.4%，原因:細(xì)胞破碎后,仍有較多酶吸附在細(xì)胞碎片上。2023/2/5五.高壓勻漿—化學(xué)法結(jié)合

先高壓勻漿，再加10%丁酯，37℃攪拌3h，高速離心(3萬(wàn)rpm)，釋放率：R=75%第三節(jié)破碎率的測(cè)定及破碎技術(shù)

的研究方向2023/2/5細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。直接測(cè)定法目的產(chǎn)物測(cè)定法3)導(dǎo)電率測(cè)定法采用染色法區(qū)別破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞如破碎的革蘭氏陽(yáng)性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物含量或活性，并與100%破碎率的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計(jì)算其破碎率。一、破碎率的測(cè)定2023/2/5二、破碎技術(shù)的研究方向多種破碎方法相結(jié)合化學(xué)法、酶法、機(jī)械法相結(jié)合。酶法與高壓勻漿、超聲波震蕩、鰲合劑、滲透壓法結(jié)合如用溶解酶預(yù)處理面包酵母，然后高壓勻漿，95MPa壓力下勻漿4次，總破碎率接近100%。而單獨(dú)采用高壓勻漿法，同樣條件下破碎率只有32%。有機(jī)溶劑與凍融法、干燥法結(jié)合2023/2/5破碎技術(shù)的研究方向

-與上游過(guò)程相結(jié)合在生長(zhǎng)后期，加入某些能抑制或阻止細(xì)胞壁物質(zhì)合成的抑制劑(如青霉素)，使新生細(xì)胞細(xì)胞壁有缺陷，利于破碎；選擇較易破碎的菌種作為宿主細(xì)胞，如革蘭氏陰性細(xì)菌；用基因工程的方法對(duì)菌種進(jìn)行改造。2023/2/5破碎技術(shù)研究方向-與下游工程相結(jié)合

舉例：萃取破碎法提取酵母醇脫氫酶2023/2/5（inclusionbodiesIBs)第四節(jié)包涵體的純化胞外分泌型表達(dá)：離心,收集液相→濃縮→純化。胞內(nèi)表達(dá)：胞內(nèi)可溶性表達(dá)：離心,收集菌體→細(xì)胞破碎→離心，收集上清→純化。胞內(nèi)周質(zhì)表達(dá)：離心,收集菌體→低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標(biāo)物→離心,收集上清液→純化。不溶性包涵體：離心,收集菌體→細(xì)胞破碎→離心,收集沉淀→包涵體洗滌→目標(biāo)蛋白變性溶解→復(fù)性→純化。2023/2/5生物分離過(guò)程的一般流程本節(jié)內(nèi)容2023/2/5外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體β-丙酰胺酶20%在細(xì)胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長(zhǎng)激素>30%形成包涵體β-內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包涵體人胰島素原5%~26%形成包涵體2023/2/5包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標(biāo)蛋白、菌體蛋白等。目標(biāo)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒(méi)有生物活性。包涵體的形成的原因？蛋白過(guò)量積聚，超過(guò)溶解度，導(dǎo)致沉淀；蛋白生成太快，分子間疏水基團(tuán)相互作用而聚集沉淀；分子內(nèi)部二硫鍵的錯(cuò)誤連接導(dǎo)致沉淀；表達(dá)蛋白過(guò)多，與其結(jié)合/誘導(dǎo)組分不足，不能形成溶解狀態(tài)；蛋白質(zhì)自身不穩(wěn)定。包涵體的構(gòu)成2023/2/5基因工程包涵體的純化方法收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎包涵體的洗滌目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的復(fù)性包涵體的出現(xiàn)不僅增加了生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為蛋白質(zhì)折疊機(jī)理研究提出了新的課題。欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。2023/2/51）包涵體的洗滌細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時(shí)會(huì)與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來(lái)困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）