薄層色譜法概述課件

第四章薄層色譜法2/5/20231概述1938年俄國(guó)人首先實(shí)現(xiàn)了在氧化鋁薄層上分離一種天然藥物。1965年德國(guó)化學(xué)家出版了“薄層色譜法”一書，推動(dòng)了這一技術(shù)的發(fā)展。因TLC法設(shè)備簡(jiǎn)單，分析速度快，分離效率高，結(jié)果直觀，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期發(fā)展了高效薄層色譜。80年代以后發(fā)展了薄層色譜光密度掃描儀，和各步操作的儀器化，并實(shí)現(xiàn)了計(jì)算機(jī)化。2/5/20232薄層色譜與高效液相色譜的差別（特點(diǎn)）固定相和流動(dòng)相TLC——流動(dòng)相流動(dòng)靠毛細(xì)作用力，流動(dòng)相選擇較少受限制，固定相不用再生。而HPLC是在封閉的系統(tǒng)內(nèi)，流動(dòng)相流量靠泵控制，溶劑選擇受檢測(cè)器限制，固定相需再生。樣品處理TLC要求沒有HPLC嚴(yán)格。2/5/20233色譜分離TLC可同時(shí)分離多個(gè)樣品，并可采用相同或不同溶劑進(jìn)行同向或雙相多次展開，通常采用正相色譜，色譜后衍生化方便。HPLC一次只能分離一個(gè)樣品，通常采用反相色譜，色譜后衍生化受限制。對(duì)污染物抗受力強(qiáng)TLC——顆粒物質(zhì)、腐蝕性物質(zhì)、不可逆吸附物質(zhì)均無影響。HPLC——顆粒物質(zhì)、腐蝕性物質(zhì)、不可逆吸附物質(zhì)均有大的影響。2/5/20234薄層色譜系統(tǒng)薄層板未改性固定相硅膠—為使用最廣泛的薄層材料氧化鋁—有堿性、中性、酸性硅藻土—為化學(xué)中性吸附劑纖維素—天然多糖類聚酰胺—為特殊類型有機(jī)薄層材料，對(duì)能形成氫鍵的物質(zhì)有特別的選擇性。2/5/20235表面改性固定相疏水改性硅膠——化學(xué)鍵合烷基親水改性硅膠——引入氨基、氰基、二羥基等，薄層板極性介于極性吸附劑和疏水改性劑之間（極性次序：硅膠﹥氨基﹥氰基﹥二羥基﹥反相）。表面改性纖維素——乙?；w維素藥典收載的固定相有：硅膠類、硅藻土類、氧化鋁類、微晶纖維素類等。顆粒直徑一般要求10–40um。2/5/20236載板——玻璃板，放在飽和碳酸鈉溶液中浸泡數(shù)小時(shí)，除去玻璃表面的油污。然后充分漂洗干凈，干燥，置干燥器中備用。要求光滑、平整、洗凈后不附水珠。黏結(jié)劑無機(jī)黏結(jié)劑——石膏（硫酸鈣），添加石膏的吸附劑以字母“G”表示。沒有黏結(jié)劑的吸附劑以字母“H”表示。無機(jī)黏結(jié)劑的優(yōu)點(diǎn)是：耐高溫，耐酸堿，但涂鋪薄板動(dòng)作要快，否則勻漿易凝固。薄層強(qiáng)度差。2/5/20237有機(jī)黏結(jié)劑——羧甲基纖維素鈉（CMC）、淀粉、聚乙烯醇、高分子聚合物等。其特點(diǎn)是薄層強(qiáng)度高、使用方便，但不能用濃硫酸作顯色劑。熒光黏結(jié)劑——在吸附劑中添加某種熒光指示劑，常用的熒光指示劑在254nm紫外光下發(fā)藍(lán)色熒光的有鈉熒光素、硫化鎘、陰極綠等。在366nm有熒光的指示劑如彩藍(lán)等。含有熒光指示劑的商品吸附劑以“F”表示，并以下標(biāo)注明其激發(fā)光波長(zhǎng)。例硅膠HF254

2/5/20238薄層板涂鋪要求：均勻、平整、無氣泡引起的凹坑和龜裂。例：硅膠板（粒度10～40um）硅膠G——將硅膠置研缽中，加入少量水，研磨均勻，至無結(jié)塊和氣泡，再加入比例量的水(一般為1份固定相與3份水)，迅速研磨均勻，立即涂鋪。硅膠或硅膠G——以CMC為黏合劑。配制0.2%～0.7%CMC水溶液,放置過夜,使懸浮的纖維沉降,取上層用來配制吸附劑勻漿。2/5/20239反相薄層板制備——以不同鏈長(zhǎng)的正構(gòu)烷烴為固定液,配制成適當(dāng)濃度的溶液(如5%硅酮油乙醚溶液),浸漬硅膠板。薄層板活化涂布后的薄層先在室溫下陰干，在使用前置適當(dāng)溫度烘烤一定時(shí)間進(jìn)行活化，然后置干燥器中備用。不同薄層活化條件略有不同，如：硅膠110℃1h氧化鋁110℃30min2/5/202310點(diǎn)樣要求配制樣品的溶劑高度揮發(fā)性和盡可能非極性，否則易使斑點(diǎn)擴(kuò)展。采用多次點(diǎn)加法，第二次點(diǎn)加時(shí)應(yīng)待前一次點(diǎn)加的溶劑揮發(fā)后再進(jìn)行。點(diǎn)樣量應(yīng)適中，過載會(huì)引起斑點(diǎn)拖尾，分離度變差，以最小檢測(cè)量的幾倍～幾十倍為宜。手工點(diǎn)樣工具：定容玻璃毛細(xì)管（1–5ul），微量注射器。2/5/202311自動(dòng)點(diǎn)樣LimomatIV噴樣儀——樣品溶液通過氣流成霧狀噴向薄層，移動(dòng)板臺(tái)，使在薄層上流下樣品條帶。特點(diǎn)：適合于大量稀樣品溶液的噴加；條帶寬度不超過2mm，有利于改善分辨率；便于狹縫式光密度計(jì)掃描；要求薄層板強(qiáng)度高。自動(dòng)薄層色譜點(diǎn)樣儀——由計(jì)算機(jī)控制。藥典規(guī)定：點(diǎn)樣基線距底邊2.0cm,樣點(diǎn)直徑2-4mm,點(diǎn)間距離約為1.5-2.0cm。2/5/202312展開方式多數(shù)采用直線形上行展開，薄層板水平角度以75為最佳。展開距離一般為10-15cm。多次展開——一次展開未達(dá)滿意分離時(shí)，可將薄層板干燥后再次用同一種溶劑展開，可重復(fù)多次，直到混合物分離為止。分步展開——混合物性質(zhì)差別較大時(shí)，一種流動(dòng)相不能有效分離時(shí)，可采用不同溶劑依次展開不同距離。2/5/202313連續(xù)展開——使到達(dá)薄層上緣的溶劑不斷蒸發(fā)，連續(xù)展開以增加展開距離。因無溶劑前沿，需要有個(gè)參照物同時(shí)展開，以計(jì)算相對(duì)保留值。二維展開——在兩個(gè)垂直的方向上進(jìn)行展開。將樣品點(diǎn)在薄層板的一個(gè)角上，展開適當(dāng)距離后，揮干溶劑，再將薄層板以與原展開方向成90的方向進(jìn)行展開。原點(diǎn)122/5/202314離心展開——薄層板以適當(dāng)轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)時(shí)，流動(dòng)相以適當(dāng)速率轉(zhuǎn)移到薄層上。該技術(shù)主要用于制備色譜。鍥尖技術(shù)——圓形離心展開具有分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，但需要有一定的儀器裝置。采用鍥尖技術(shù)可以在一般的展開室中進(jìn)行類似展開。薄層被刮掉部分溶劑前沿2/5/202315檢測(cè)物理方法——紫外光下顯示熒光或熒光淬滅化學(xué)方法——加化學(xué)試劑顯色，要求顯色穩(wěn)定、持久、專屬、靈敏、線性良好。斑點(diǎn)定位方法碘蒸氣法——靈敏、簡(jiǎn)便，為通用顯色法。將碘結(jié)晶放在密封的展開缸中，碘的升華，使缸內(nèi)充滿紫色的碘蒸氣。將展開后的板揮干溶劑置碘缸中至薄層色譜上出現(xiàn)棕色斑點(diǎn)。放置時(shí)間不宜太長(zhǎng)，否則背景吸附劑也吸附碘，使信噪比降低。用針頭將斑點(diǎn)標(biāo)記下來，放在通風(fēng)處使碘揮發(fā)。2/5/202316薄層色譜參數(shù)保留參數(shù)（Rf值）用來表征斑點(diǎn)位置的基本參數(shù)是保留因子，通常稱作比移值，用Rf表示。Rf=Ls/L。，原點(diǎn)SRWLsL。Lr原點(diǎn)參比樣品前沿2/5/202317注意：同一物質(zhì)在不同展開方式中得到的比移值是不相同的。在同樣溶劑的重復(fù)n次的多次展開后的比移值(Rf)n=1-(1-Rf)n。相對(duì)比移值（Rx）Rf測(cè)量中一個(gè)重要的誤差來源是難以確定溶劑前沿的位置，因此，引入相對(duì)比移值（Rx）。

Rx=Ls/Lr2/5/202318分離效能參數(shù)理論塔片數(shù)n=16[Ls/W]2，考慮靜態(tài)擴(kuò)散引起的起始斑點(diǎn)半峰寬的影響引入真實(shí)塔片數(shù)（n真實(shí)）n真實(shí)=5.54[Ls/（b0.5-b0）]2b0.5為樣品斑點(diǎn)半峰寬，b0樣品起始斑點(diǎn)半峰寬。塔片高度h真實(shí)=Ls/n真實(shí)

2/5/202319容量因子（k）與比移值（Rf）k=ts/tm（物質(zhì)在兩相中滯留時(shí)間之比）又k=K（Vs/Vm）Rf=Vm/（Vm+KVs）=1/（1+k）k∞94210.50Rf00.10.20.330.50.6712/5/202320分離參數(shù)R=因Ls=RfL。，同時(shí)對(duì)相鄰的兩個(gè)斑點(diǎn)，假定W1=W2=W則R=L。=×⊿Rf與n=16[Ls/W]2式合并，得：2(Ls2-Ls1)W1+W2Rf2-Rf1WL。W2/5/202321R=由上式，Rf與R之間存在著如圖所示關(guān)系×

4⊿RfRf10.10.30.50.70.9Rf1R1.000.750.50.250Rf=0.3,R最高Rf在0.2-0.5,R變化不大Rf﹤0.1或﹥0.7,R下降

2/5/202322流動(dòng)相與展開體系液-固吸附——在該色譜中，溶質(zhì)的保留和分離選擇性決定于三個(gè)因素：溶解能力流動(dòng)相溶質(zhì)吸附劑相互作用競(jìng)爭(zhēng)2/5/202323液-液分配基于組分在互不相溶的兩相間的溶解度不同而實(shí)現(xiàn)分離的一種展開系統(tǒng)?？稍谡归_前，將薄層板浸入某種液體固定相。實(shí)際上在TLC中，分配與吸附是并存的（大氣中水分也是一種固定相）。此外還有：化學(xué)鍵合相反相展開、化學(xué)鍵合相正相展開、離子交換、離子對(duì)色譜、凝膠、膠束、手性展開。2/5/202324溶劑強(qiáng)度參數(shù)和選擇性溶劑的強(qiáng)度參數(shù)定義：溶劑強(qiáng)度參數(shù)用表示。流動(dòng)相強(qiáng)度越高，表示它與吸附劑相互作用力強(qiáng)。溶質(zhì)的Rf值就越大。為得到滿意的分離，選用的流動(dòng)相使溶質(zhì)的Rf值在0.3–0.7之間為宜。溶劑強(qiáng)度也可用其在水中的溶解度參數(shù)來表示。2/5/202325一些常用溶劑的溶劑強(qiáng)度與溶解度參數(shù)溶劑

溶劑

正己烷0.017.3環(huán)己烷0.048.2苯0.329.2乙醚0.387.4二氯甲烷0.429.6正丙醇0.8210.2正丁醇0.70/四氫呋喃0.579.1乙酸乙酯0.588.6氯仿0.409.1甲乙酮0.51/二氧六環(huán)0.569.8吡啶0.7110.4丙酮0.509.4乙醇0.88/乙酸1.0012.4二甲亞砜0.7512.8甲醇0.9512.9乙二醇1.1114.7甲酰胺/17.92/5/202326流動(dòng)相選擇時(shí)需考慮溶劑的下列情況一些溶劑如氯仿、乙醚一般含有微量乙醇作保護(hù)劑，有時(shí)需重蒸除去乙醇。許多溶劑有吸濕性，使溶劑含水量不一致，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)難以重現(xiàn)。溶劑儲(chǔ)藏時(shí)間和條件對(duì)溶劑質(zhì)量影響，應(yīng)注意出廠日期?；旌狭鲃?dòng)相組分之間（或雜質(zhì)）可能發(fā)生相互作用。對(duì)于易揮發(fā)的溶劑，難于配制穩(wěn)定組成的流動(dòng)相。要求操作格外小心，同時(shí)混合流動(dòng)相不應(yīng)重復(fù)使用。2/5/202327溶劑的選擇性指溶劑引起兩種溶質(zhì)位移差別的能力，即分離度。R=1/4（-1）[k/（k+1）]

分離因子=k1/k2，k為k1和k2的平均值由上式可見，R取決于三個(gè)因子：理論塔片n主要是吸附劑性質(zhì)的函數(shù)k反映了兩種溶質(zhì)的平均遷移速度，其由流動(dòng)相溶劑強(qiáng)度決定

取決于吸附劑和流動(dòng)相的組成2/5/202328溶劑優(yōu)化規(guī)則：增加溶劑強(qiáng)度，使Rf值增大，但也可能降低分離能力。流動(dòng)相中較強(qiáng)組分的體積比小于5%或大于50%，選擇性最大，此時(shí)最有利于溶質(zhì)與流動(dòng)相組分的選擇性相互作用。用乙醚或甲醇代替流動(dòng)相中的一種較強(qiáng)組分，由于形成氫鍵可改善選擇性。若出現(xiàn)斑點(diǎn)拖尾，可向流動(dòng)相中加少量水，或降低薄層活性，有利于改善分離。也可采用兩種強(qiáng)溶劑與一種弱溶劑組成的三元混合流動(dòng)相，此時(shí)，溶劑強(qiáng)度由弱溶劑控制，而溶劑選擇性則由兩強(qiáng)溶劑控制。2/5/202329斑點(diǎn)的擴(kuò)散與形狀在TLC中斑點(diǎn)的移動(dòng)與擴(kuò)散是二維的，因?yàn)榘唿c(diǎn)在展開方向和與之垂直方向上的擴(kuò)散速度是不相等的，展開劑的移動(dòng)速度也是不等的，在單位體積或單位質(zhì)量薄層內(nèi)所含的溶劑量越接近溶劑前沿減少得越明顯，直至溶劑前沿時(shí)為零，這一現(xiàn)象稱為“溶劑的體積梯度”，在各種展開形式中均存在。當(dāng)然，對(duì)于這一問題實(shí)際上只是在定量斑點(diǎn)濃度時(shí)才需要考慮。2/5/202330同時(shí)一種成分的色譜行為會(huì)受到混合物中其他成分的影響，這種影響的大小取決于混合成分的種類、濃度、以及斑點(diǎn)間的距離等。這種影響一般使分配系數(shù)變小。如兩個(gè)相鄰斑點(diǎn)中后面的一個(gè)展開速度較其單獨(dú)展開時(shí)為大。2/5/202331固定相的活度及其調(diào)節(jié)在其他因素一定時(shí)，活度增加，Rf值減少，反之亦然?？赏ㄟ^預(yù)吸附溶劑分子，調(diào)節(jié)其表面活性。例如可將活化薄層板放在相對(duì)濕度恒定的空間里來達(dá)到調(diào)節(jié)活度的目的。實(shí)際工作中常常使固定相預(yù)吸附一定量單一或混合溶劑蒸氣，預(yù)吸附量越大，溶劑前沿運(yùn)動(dòng)速度越快，物質(zhì)斑點(diǎn)的Rf值越小。預(yù)吸附還可能影響Rf在0.6-1.0之間的斑點(diǎn)的分離。2/5/202332在層析過程中發(fā)生的邊緣效應(yīng)就是由于這種因素引起的。尤其是使用混合溶劑時(shí)，極性較弱和沸點(diǎn)較低的溶劑，在薄層邊緣容易揮發(fā)，使邊緣部分的展開劑中極性溶劑的比例增大，Rf相對(duì)增大。同一物質(zhì)在同一薄層板上出現(xiàn)中間部分的Rf值比邊緣的Rf值小，即邊緣效應(yīng)，若在展開前先將展開槽與薄層板用展開劑蒸氣飽和后再展開，邊緣效應(yīng)可消失。采用雙槽層析缸尤為有利。2/5/202333預(yù)吸附中展開中展開過程中用不同于展開劑的溶劑調(diào)節(jié)槽內(nèi)氣氛2/5/202334薄層掃描原理薄層定量方法可分為直接法——測(cè)定照射光照射色譜后，因被測(cè)物斑點(diǎn)的存在引起的透射光和反射光的變化。并通過隨行標(biāo)準(zhǔn)比較待測(cè)斑點(diǎn)的量。間接法——將部分照射光的能量轉(zhuǎn)換成較長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光，即熒光測(cè)量。薄層色譜定量測(cè)定的光學(xué)方法是基于測(cè)量斑點(diǎn)和薄層空白處光學(xué)響應(yīng)信號(hào)的差值。2/5/202335一強(qiáng)度為I的光照射薄層時(shí)，被照射的一面為“近表面”，另一面為“遠(yuǎn)表面”。近表面遠(yuǎn)表面光（I）鏡反射或表面反射Is(表面平滑)漫反射(表面粗糙)入射強(qiáng)度I0

出射強(qiáng)度(IT)IT/I0為薄層透射率AT返回光強(qiáng)(IR)IR/I0為介質(zhì)的漫反射率ARI0-（IR+IT）=差為被介質(zhì)吸收并轉(zhuǎn)換為熱的光強(qiáng)2/5/202336光學(xué)系統(tǒng)薄層色譜掃描儀光學(xué)系統(tǒng)有三種單光束單波長(zhǎng)——受光源穩(wěn)定性和薄層質(zhì)量影響嚴(yán)重。單光束雙波長(zhǎng)——對(duì)背景不均勻引起的干擾有補(bǔ)償作用，選擇的兩個(gè)波長(zhǎng)應(yīng)接近些。雙光束單波長(zhǎng)——可補(bǔ)償光源不穩(wěn)引起的誤差，但對(duì)板層不均勻無作用。光單色器檢測(cè)器光波長(zhǎng)1波長(zhǎng)2檢測(cè)器斬波器光單色器分光鏡檢測(cè)器檢測(cè)器2/5/202337透射光法測(cè)定組分對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)對(duì)特定波長(zhǎng)光的吸收度來確定含量。將薄層板從左至右移動(dòng)，對(duì)斑點(diǎn)掃描，單色光透過薄層板后被記錄下來，將測(cè)得的吸收度對(duì)Rf值繪制掃描曲線，得薄層色譜圖光源單色器2/5/202338反射光法一定波長(zhǎng)的光照射薄層，穿進(jìn)薄層內(nèi)的光部分被薄層吸收，部分經(jīng)過漫反射又折回表面成為反射光。當(dāng)對(duì)薄層進(jìn)行掃描時(shí)，測(cè)量其反射吸收度，可得到反射光譜。反射吸收度與物質(zhì)含量有確定關(guān)系，可進(jìn)行定量。光源單色器2/5/202339掃描方式直線式掃描——照射在薄層板上的光束與薄層板作直線相對(duì)運(yùn)動(dòng)。光束固定，掃描板臺(tái)運(yùn)動(dòng)。光束落在薄層上的截面為一長(zhǎng)方形帶。鋸齒式掃描——照射在薄層板上的光束與薄層板的相對(duì)運(yùn)動(dòng)軌跡呈鋸齒形或矩形。直線掃描鋸齒掃描輪廓曲線積分曲線2/5/202340斑點(diǎn)斑點(diǎn)A

B

CABCCAB對(duì)于不規(guī)則斑點(diǎn)，兩種掃描結(jié)果不一樣。同一斑點(diǎn)從A、B、C三個(gè)不同方向掃描，鋸齒掃描所得積分值變動(dòng)小，而直線掃描所得積分值變動(dòng)大。2/5/202341測(cè)量方式吸光度測(cè)量——測(cè)定的是漫反射光。適合于本身有顏色或有紫外吸收的物質(zhì)。I0IR檢測(cè)器2/5/202342熒光測(cè)量——靈敏度較吸光度測(cè)量高，板層不吸收發(fā)射光，測(cè)量噪音小，基線穩(wěn)定。為消除激發(fā)光的影響，在板層和檢測(cè)器之間必須加一塊濾光片，以截去反射激發(fā)光，只讓發(fā)射的熒光抵達(dá)檢測(cè)器。濾光片熒光檢測(cè)器2/5/202343熒光淬滅測(cè)量——吸附劑有熒光，樣品斑點(diǎn)無熒光，在紫外光照射下，被測(cè)物在熒光背景上顯示出暗灰斑點(diǎn)。本法適合于本身無顏色，又無特征紫外吸收或熒光的物質(zhì)。該測(cè)量技術(shù)有三種形式：測(cè)熒光測(cè)紫外光測(cè)紫外和熒光2/5/202344掃描儀機(jī)械掃描儀——可進(jìn)行吸光度和熒光測(cè)量，以反射測(cè)量方式為主，也有能提供透射測(cè)量方式的（主要用于電泳譜圖掃描測(cè)量）。高速掃描系統(tǒng)——可分為兩類光柵掃描系統(tǒng)位敏掃描系統(tǒng)這類掃描儀技術(shù)上一些問題還未解決。2/5/202345掃描定量中的標(biāo)準(zhǔn)曲線校正薄層板上由于光被吸附劑散射，不能得到象通常溶液測(cè)定時(shí)的吸光度和濃度之間的簡(jiǎn)單直線關(guān)系。即物質(zhì)濃度越大，薄層試樣板上測(cè)定的反射吸光度比直線關(guān)系所示值越低。掃描儀系統(tǒng)設(shè)計(jì)時(shí)考慮到這一問題，采用微機(jī)處理使標(biāo)準(zhǔn)曲線直線化。在理論曲線上選擇吸光度0–1之間的7個(gè)點(diǎn)，將各吸光度值轉(zhuǎn)換為直線上的值，得到一條通過原點(diǎn)的直線。2/5/202346吸光度1.00物質(zhì)量經(jīng)變換后的直線理論曲線直線化方法示意圖校正過度校正適當(dāng)校正不足未校正試樣量積分值校正情況判斷2/5/202347使用直線化功能時(shí)的注意事項(xiàng)發(fā)色試樣的測(cè)定——對(duì)于沒有吸收的試樣進(jìn)行發(fā)色測(cè)定時(shí)，一般不使用直線化功能就可以得到近似的直線關(guān)系。試樣變質(zhì)時(shí)——試樣展開后，應(yīng)馬上進(jìn)行測(cè)定，如果放置一星期后再測(cè)定。即使近似地呈直線狀也往往不能通過原點(diǎn)，認(rèn)為是試樣變質(zhì)所引起的。展開距離——同一試樣等量點(diǎn)樣，同樣展開，展開距離不同將引起誤差。展開方法——使用直線化功能定量時(shí)，為避免展開距離不同產(chǎn)生的誤差，實(shí)際定量時(shí)，將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在同一塊板上展開是較理想的。2/5/202348定性、定量方法定性方法利用保留值測(cè)定Rf值測(cè)定相對(duì)Rf值，即Rx值。利用二維色譜（改變色譜條件，比較Rf值是否一致）sb1b2b2sb1sb1b2點(diǎn)樣第一次展開第二次展開2/5/202349通過板上化學(xué)反應(yīng)反應(yīng)后生成特征顏色的化合物反應(yīng)后生成復(fù)雜的混合物，根據(jù)生成物的“指紋”特征加以鑒定?？捎糜诙ㄐ缘陌迳戏磻?yīng)有：乙?；?、濃硫酸脫水、偶氮化、酯化、鹵化、酸堿水解