第二章 微生物發(fā)酵制藥技術

第二章微生物發(fā)酵制藥技術第一節(jié)概述一、微生物發(fā)酵制藥的發(fā)展簡史自然發(fā)酵時期純培養(yǎng)技術時期通氣攪拌的好氣性發(fā)酵工程技術時期人工誘變育種與代謝控制發(fā)酵工程技術時期發(fā)酵動力學和連續(xù)化、自動化發(fā)酵工程技術時期微生物酶反應合成與化學合成相結合工程技術時期發(fā)酵工程的4個階段第一階段1676年制成第一臺顯微鏡——微生物的存在1857年巴斯德證明了酒精是由活的酵母發(fā)酵引起的1897年畢希納發(fā)現(xiàn)磨碎的酵母仍使糖發(fā)酵形成酒精——酶第二階段對發(fā)酵技術的認識起始于19世紀末，主要來自于厭氧發(fā)酵，如利用酵母菌、乳酸菌生產酒精、乳酸和各種發(fā)酵食品。第三階段20世紀40年代初，第二次世界大戰(zhàn)爆發(fā)，青霉素迅速工業(yè)大規(guī)摸生產。深層培養(yǎng)、生產大規(guī)?；?、多種抗生素、氨基酸、核酸發(fā)酵成功。第四階段20世紀50年代，利用代謝調控發(fā)酵氨基酸、核酸。20世紀70年代，利用固定化酶或細胞連續(xù)發(fā)酵。20世紀80年代，基因工程、蛋白質工程、細胞融合技術等高新技術應用階段。發(fā)酵工程制藥的特點微生物菌種選育獲得高產發(fā)酵的理論產量存在約10%的變量發(fā)酵過程常溫常壓，操作條件溫和純種培養(yǎng)、無菌條件生產過程是以生物體的自動調節(jié)方式進行的分子水平生產，定向發(fā)酵、突變、雜交等手段投資少、見效快發(fā)展趨勢利用DNA重組技術和細胞工程技術的發(fā)展、新的工程菌和新型微生物的開發(fā)新型的生理活性多肽和蛋白質類藥物：干擾素、白介素促紅細胞生成素等；新型菌體制劑和疫苗。紅細胞生成素

(治療貧血)

生長激素

(促進生長)胰島素

(治療糖尿病)

干擾素

(抗病毒、抗腫瘤)

二、微生物發(fā)酵制藥研究的內容利用微生物技術，通過高度工程化的新型綜合技術，以利用微生物反應過程為基礎，依賴于微生物機體在反應器內的生長繁殖及代謝過程來合成一定產物，通過分離純化進行提取精制，并最終制劑成型來實現(xiàn)藥物產品的生產。1、微生物菌體的發(fā)酵SCP、藥用真菌（冬蟲夏草、茯苓等）生物防治制劑（如蘇云金桿菌）活性乳制劑細胞的生長與產物的積累成平行關系，生長速率最大的時期也是產物合成最高階段三、微生物發(fā)酵藥物的來源單細胞蛋白質的優(yōu)點①生長繁殖迅速：生產能力可達2～6kg/（m3.h）。②不受外界條件的影響，可以人工控制工業(yè)化生產。③營養(yǎng)價值高：微生物細胞內蛋白質含量（占細胞干物質）：

細菌60～80％，

小球藻和螺旋藍細菌50～65％

酵母菌40～55％，

霉菌20～50％

大豆35～40％,

小麥10～12％，牛肉18～22％此外這些微生物細胞中還含有豐富的碳水化合物和維生素、麥角甾醇、礦物質、各種酶和未知生長因子2、微生物酶發(fā)酵各種酶制劑糖化酶、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等天冬酰胺酶：抗癌納豆激酶、鏈激酶：治療血栓青霉素酰化酶：青霉素生產需要誘導或遭受阻遏、抑制等調控作用，在菌種選育、培養(yǎng)基配制以及發(fā)酵條件等方面需注意。3、微生物代謝產物發(fā)酵初級代謝產物：與菌體生長相伴隨的產物、對菌體生長、分化和繁殖是必須的氨基酸、核苷酸、維生素、糖類等菌體對其合成反饋控制嚴密，一般不過量積累次級代謝產物：與菌體生長不相伴隨，以初級代謝的中間產物為原料而合成抗生素、生物堿、毒素、色素、胞外多糖等結構常較復雜對環(huán)境條件敏感4、微生物轉化發(fā)酵利用微生物細胞的一種或幾種酶，對外源化合物的特定部位進行加工，如加入羥基、還原雙鍵、脫氧或切斷支鏈等。反應最顯著的特點是特異性強，包括反應特異性、結構位置特異性、立體特異性。如：甾體轉化：環(huán)戊烷多氫菲核的化合物可的松（Cortisone）學名：11-脫氫-17-羥皮質酮。由皮質醇分子C-11上的羥基氧化為酮基而得的一種糖皮質素。給藥后在體內轉變?yōu)槠べ|醇而發(fā)揮其強抗炎性。

四、微生物發(fā)酵藥物的分類生物來源作用對象作用機制化學結構細菌真菌放線菌抗菌藥抗腫瘤藥抗病毒藥除草劑酶抑制劑免疫調節(jié)劑抑制細胞壁合成藥影響細胞膜功能藥干擾蛋白質合成藥抑制核酸合成藥抑制生物能量反應藥抗生素維生素氨基酸核苷酸甾體激素酶及酶抑制劑第二節(jié)制藥微生物與產物的生物合成一、常見的制藥用微生物細菌放線菌真菌細菌之大腸桿菌屬(Escherichiacoli)生產天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸等氨基酸類藥物基因工程的載體細菌之短桿菌屬(Brevibacterium)維生素B12、氨基酸、核苷酸類藥物生產中常用的菌種，也是酶法合成生產輔酶A的菌種。細菌之棒狀桿菌屬(Corynebacterium)生產氨基酸、核苷酸類藥物，用于甾體轉化是谷氨酸和其他氨基酸的高產菌，如北京棒桿菌AS1.299鈍齒棒桿菌AS1.542細菌之芽孢桿菌屬(Bacillus)生產氨基酸、核苷酸、抗生素類、維生素B12、用于甾體轉化等。細菌之假單胞菌屬(Pseudomonas)生產維生素B12、氨基酸、核苷酸類；進行類固醇（甾體）轉化；有些菌株可利用烴類生產單細胞蛋白。細菌之乳酸桿菌屬(Lactobacillus)生產抗癌類藥物放線菌抗生素12000余種，60%左右來自放線菌，經濟價值大。放線菌之鏈霉菌屬(Streptomyces)灰色鏈霉菌(Streptomyces

griseus)

產鏈霉素金霉素鏈霉菌(Streptomyces

aureofaciens)產金霉素紅霉素鏈霉菌(Streptomyces

erythreus)

產紅霉素龜裂鏈霉菌(Streptomyces

rimosus)產土霉素放線菌之諾卡氏菌屬(Norcadia)生產利福霉素、蚊霉素等放線菌之小單胞菌屬(Micromonospora)多種可產抗生素，如棘孢小單胞菌(M.echinospora)產慶大霉素。放線菌之游動放線菌屬（Actinoplanes）典型代表：濟南游動放線菌(Actinoplanes

tsinanesisn)產創(chuàng)新霉素(creatmycin；1964)創(chuàng)新霉素分子結構

真菌之根霉屬(Rhizopus)生產甾體激素、延胡索酸及酶制劑等。真菌之曲霉屬(Aspergillus)生產枸櫞酸、葡萄糖酸、有機酸類、抗生素，進行甾體轉化。真菌之青霉屬(Penicillum)產黃青霉(Penicillum

chrysogenum)

生產青霉素，也可用來生產葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、檸檬酸和抗壞血酸真菌之頭孢霉菌屬(Cephalosporium)產黃頭孢霉(Cephalosporium

chrysogen)、頂孢頭孢霉菌(Cephalosporium

acremonium)

都生產頭孢菌素C真菌之酵母菌屬(Saccharomyces)啤酒酵母(Saccharomyces

cerevisiae)：生產啤酒、酒精、藥用酵母等；核酸、麥角固醇、細胞色素C、凝血質和輔酶A等。紅酵母(Rhodotorula)：β-胡蘿卜素棉病針孢酵母(Nematspora

gossypii)：核黃素真菌之其它牛肝菌屬：含有人體必需的8種氨基酸，還含有腺膘呤、膽堿和腐胺等生物堿。靈芝屬：靈芝多糖、靈芝多肽、三萜類、16種氨基酸(其中含有七種人體必需氨基酸)、蛋白質、甾類、甘露醇、香豆精苷、生物堿、有機酸（主含延胡索酸），以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。二、制藥微生物菌種的選育生產力：能在廉價的培養(yǎng)基上迅速生長，所需的代謝產物的產量高，其它類似代謝產物少操作性：培養(yǎng)條件簡單，發(fā)酵易控制，產品易分離穩(wěn)定性：抗噬菌體能力強，菌種純粹，遺傳性狀穩(wěn)定、不易變異退化安全性：非病源菌，不產有害生物活性物質或毒素發(fā)酵菌種的選育方法從自然界中獲得新菌種誘變育種雜交育種原生質體融合基因工程從自然界中獲得新菌種土壤、空氣、動植物等，嚴重污染的水域，極端環(huán)境等基本程序：采樣預處理富集培養(yǎng)篩選鑒定野生型菌株誘變育種物理或化學方法誘發(fā)突變物理誘變劑：紫外線、X-射線、γ-射線等化學誘變劑：氮芥、亞硝酸、5-氟尿嘧啶等雜交育種：借助有性重組，使不同菌株的遺傳物質得以交換

原生質體融合育種：借助原生質融合技術實現(xiàn)遺傳物質的交換

基因工程育種：DNA體外重組技術定向育種，技術含量高，應用面廣三、制藥微生物菌種的保藏

(Cultureconservation)目的：保證菌種經過較長時間后仍保持生活能力，防止被雜菌污染，形態(tài)特征和生理形狀盡可能不發(fā)生變異。菌種保藏三要素典型菌種的優(yōu)良純種的休眠體；創(chuàng)造有利于種子休眠的環(huán)境（低溫、干燥、缺氧、避光、缺少營養(yǎng)）；盡可能采用多種不同的手段保藏同一菌株。菌種保藏的常用方法斜面低溫保藏法石蠟油封存法砂土管保藏法麩皮保藏法甘油懸液保藏法冷凍真空干燥保藏法液氮超低溫保藏法宿主保藏法方法名稱主要特點適用范圍保藏期斜面低溫保藏法傳代培養(yǎng)，4℃保藏各種微生物的短期保藏。1-6個月石蠟油封存法石蠟油隔絕空氣，室溫或4℃保藏各種微生物的中短期保藏，不適用某些能分解烴類的菌種。1-2年砂土管保藏法沙土管作載體，干燥器中抽真空，室溫或4℃保藏產孢子微生物和芽孢細菌的長期保藏，不適用對干燥敏感的微生物1-10年麩皮保藏法麩皮作載體，干燥，4℃保藏產孢子霉菌和某些放線菌，工廠多采用此法1年甘油懸液保藏法懸浮于10-15%甘油中，需低溫冰箱基因工程菌1年/10年冷凍真空干燥保藏法用保護劑制備懸液，快速凍結，減壓抽真空，需凍干機各類微生物5-15年液氮超低溫保藏法保護劑，超低溫（-196℃），需超低溫液氮設備各類微生物15年以上宿主保藏法與培養(yǎng)基混合直接低溫保存專性活細胞寄生微生物（如病毒）菌種保藏機構ＡＴＣＣ中國微生物菌種資源庫ＣＣＣＣＭ中國微生物菌種保藏管理委員會ＮＣＴＣ國家標準菌庫,全國典型菌種收集委員會四、微生物代謝產物的生物合成（一）微生物合成的初級代謝產物（二）微生物次級代謝產物的生物合成基本特征：1、次級代謝產物具有種特異性2、分批發(fā)酵時，產生菌生長周期分為三個時期：菌體生長期、產物合成期以及菌體自溶期3、次級代謝產物不少是結構相似的混合物4、次級代謝產物的合成受多基因控制第三節(jié)發(fā)酵工藝條件的確定發(fā)酵的一般流程種子擴大培養(yǎng)培養(yǎng)基配制空氣除菌培養(yǎng)基滅菌發(fā)酵生產下游處理發(fā)酵設備發(fā)酵設備——發(fā)酵罐發(fā)酵罐的特點軸封嚴密，泄漏少能承受一定壓力、溫度攪拌通風裝置保證氣液充分混合具有足夠的冷卻面積死角少，滅菌徹底適宜的徑高比（高與直徑的比值為2.5—4）發(fā)酵罐的類型攪拌釜反應器鼓泡式反應器氣升式反應器發(fā)酵輔助設備無菌空氣系統(tǒng)無菌空氣的要求滅菌系統(tǒng)、管道、閥門培養(yǎng)基及其滅菌培養(yǎng)基（medium）培養(yǎng)基的成分碳源、氮源、無機鹽和微量元素、水、前體物、促進劑、抑制劑培養(yǎng)基的類型合成培養(yǎng)基（用于科學研究）復合培養(yǎng)基（用于工業(yè)生產）固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基按組成按形態(tài)按用途孢子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基影響培養(yǎng)基質量的因素原材料質量的影響水質的影響滅菌的影響pH的影響其他影響因素滅菌操作技術工業(yè)生產中常用的滅菌方法：化學物質滅菌輻射滅菌過濾介質除菌熱滅菌：包括干熱滅菌和濕熱滅菌培養(yǎng)基和發(fā)酵設備的滅菌方法：實罐滅菌（實消）空罐滅菌（空消）連續(xù)滅菌（連消）過濾器及管道滅菌無菌檢查與染菌處理無菌檢查：無菌試驗、發(fā)酵液直接鏡檢和發(fā)酵液生化分析染菌的判斷：以無菌試驗中的酚紅肉湯培養(yǎng)基和雙碟培養(yǎng)的反應為主，以鏡檢為輔。染菌防治技術：污染雜菌污染噬菌體微生物發(fā)酵方式分批發(fā)酵補料分批發(fā)酵半連續(xù)發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵發(fā)酵過程中的主要參數(shù)及控制市場部：當前發(fā)酵過程控制的技術進展。技術部：確定pH、溫度、溶氧、補料等關鍵參數(shù)的控制方法，撰寫操作規(guī)程。品控部：制定發(fā)酵過程控制的方案?？偨浝恚簠f(xié)調監(jiān)督各部工作，最后拿出完整的計劃書。發(fā)酵過程工藝控制參數(shù)一物理參數(shù)1溫度2壓力：內部壓力高于外部壓力。3攪拌轉速：轉/分鐘4攪拌功率：每立方米發(fā)酵液所消耗的功率，kw/m35空氣流量：每分鐘內每單位體積發(fā)酵液通入空氣的體積，V/V.min6粘度：反映氧傳遞阻力和菌體濃度。二化學參數(shù)1pH2基質濃度：糖、氮、磷等。3溶解氧濃度4氧化還原電位5產物濃度6廢氣中氧的含量7廢氣中CO2的含量。三生物參數(shù)1菌體濃度2菌絲形態(tài)發(fā)酵過程中的代謝變化一初級代謝產物發(fā)酵的代謝變化1菌體濃度的變化延遲期、對數(shù)生長期、靜止期和死亡期。延遲期的長短與培養(yǎng)條件和菌種生理狀態(tài)有關。在未達死亡期之前放罐。2營養(yǎng)基質濃度的變化隨發(fā)酵時間的延長不斷降低，用于菌體的生長和產物的形成。溶氧的變化規(guī)律(后面講)。3產物濃度的變化

(1)與菌體濃度平行；

(2)與培養(yǎng)條件有關。二次級代謝產物發(fā)酵的代謝變化次級代謝發(fā)酵的菌體生長(生長期)和產物合成期(生產期)是分開的。發(fā)酵過程可分為：菌體生長、產物合成、菌體自溶三個階段。1菌體生長階段

(1)營養(yǎng)成分的變化碳源、氮源和磷酸鹽等營養(yǎng)物質不斷被消耗，濃度明顯減少，而新菌體不斷合成，菌濃明顯增加。(2)攝氧率的變化隨菌濃增加，攝氧率不斷增加，溶氧濃度下降，菌濃至臨界，溶氧至最低。(3)pH

先下降后下升：利用葡萄糖產生酸，而后再被利用。先上升后下降：利用氨基酸的碳骨架，剩下氨，而后氨又被利用。限制性因素的出現(xiàn)，使菌體由生長向生產轉化。2產物合成階段產物產量不斷增多，起至達到最大值，生產速率也達最大，直至產物合成能力衰退。該階段要嚴格控制發(fā)酵條件，對產物的合成最為關鍵。例如營養(yǎng)濃度。3菌體自溶階段菌體衰老、開始自溶，氨氮含量升高，pH上升，產物合成能力衰退，生產速率下降。此時結束發(fā)酵。發(fā)酵過程的影響因素及控制菌體濃度營養(yǎng)物質溫度pH溶氧泡沫染菌發(fā)酵終點的判斷菌體濃度：單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。影響菌體生長的因素在適合的生長速率下，發(fā)酵產物的產率與菌體濃度成正比關系。特別是初級代謝產物。菌體濃度過低，產物產率下降。菌體濃度過高，產生其他影響。措施：調節(jié)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質的濃度。菌體濃度影響及其控制營養(yǎng)物質碳源氮源磷酸鹽補料：半饑餓狀態(tài)基質對發(fā)酵的影響及補料的控制碳源的影響及其控制1、碳源的種類影響代謝情況迅速利用的碳源：迅速參與代謝，合成菌體和產生能量，并產生分解產物，因此有利于菌體生長，但對產物(特別是次級代謝)有抑制作用(例如葡萄糖)。緩慢利用的碳源：可被菌體緩慢利用，有利于延長代謝產物的合成，特別有利于抗生素分泌期的延長(例如乳糖、蔗糖、麥芽糖、糊精、飴糖等)。機理解釋：乳糖的利用速度剛好符合青霉素的合成速度?？刂品椒ǎ毫骷悠咸烟腔虿捎没旌咸荚?。2、碳源濃度的影響

濃度合適。控制方法：中間補料。氮源的影響和控制1、氮源濃度的影響以谷氨酸發(fā)酵為例：NH4+太高：合成谷氨酰胺；NH4+不足：積累α-酮戊二酸。2、氮源的種類的影響速效氮源：氨基態(tài)氮和玉米漿，促進菌體生長，但對部分產物，特別是次級產物合成有抑制作用。緩慢氮源：需要經過微生物胞酶的消化才能釋放出氨基酸或NH4+，如黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉等，延長產物合成期。發(fā)酵培養(yǎng)基一般采用速效與緩慢氮源的混合物，且發(fā)酵過程中間還要補加氮源以控制其濃度。如氨基酸發(fā)酵用銨鹽（硫酸銨或醋酸銨）和黃豆餅粉水解物；鏈霉素發(fā)酵采用硫酸銨和黃豆餅粉補加有機氮源：如土霉素發(fā)酵，補加玉米漿青霉素發(fā)酵，補加尿素(2)補加無機氮源(補氮和調pH雙重功效)

補加氨水或硫酸銨是工業(yè)上常用的方法如pH偏高又需補氮時加硫酸銨磷酸鹽的影響和控制適合微生物生長的磷鹽濃度偏高0.3～300mmol；適合次級代謝產物合成的磷鹽濃度偏低，平均僅為1.0mmol，提高到100mmol就明顯抑制其合成。對抗生素發(fā)酵，一般采用亞適量。溫度對發(fā)酵的影響及其控制影響發(fā)酵溫度變化的因素產熱：生物熱和攪拌熱散熱：蒸發(fā)熱、輻射熱和濕熱溫度的變化對發(fā)酵過程的影響1、影響酶反應的速率和蛋白質的性質菌體生長所需溫度與產物合成溫度不一致(如青霉素)；溫度不同還可能影響產物合成的方向(如金霉素和四環(huán)素)。2、影響發(fā)酵液的物理性質，如溫度下降氧在發(fā)酵液中溶解度升高粘度、氧和基質的溶解與傳遞、分解和吸收最適發(fā)酵溫度是指既適合菌體的生長，又適合代謝產物合成的溫度。如乳酸的發(fā)酵，乳酸鏈球菌最適生長溫度34℃，產酸最多的溫度30℃變溫發(fā)酵如青霉素發(fā)酵30℃→25℃→2℃→25℃pH對發(fā)酵的影響及其控制影響發(fā)酵液pH變化的主要因素：菌種遺傳特性、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件如灰黃霉素發(fā)酵，乳糖為碳源pH維持在6.0～7.0

葡萄糖為碳源pH下降到3.6，發(fā)酵單位很低pH對發(fā)酵的影響及其控制一、

pH對發(fā)酵的影響1、影響微生物的生長及產物的合成(通過影響酶活性實現(xiàn))；生長最適pH與合成最適pH不一致菌體內的pH近中性，因為發(fā)酵培養(yǎng)基中的pH是通過間接方式作用與胞內酶的2、影響菌體對基質的利用速度和細胞結構(通過影響膜實現(xiàn))；例如產黃青霉在低pH下為絲狀，高pH為酵母狀3、影響產物的穩(wěn)定性；噻吶霉素在pH6.7-7.5時穩(wěn)定；青霉素在堿性條件下發(fā)酵產量低二、發(fā)酵pH的變化(影響因素)1、菌種的遺傳特性菌種具有自我調節(jié)pH能力，但能力有限度(地中?？ㄖZ氏菌發(fā)酵生產利福霉素SV)2、營養(yǎng)成分的分解代謝碳源分解代謝產生中間產物丙酮酸，產生丙酮酸的多少與碳源種類和濃度有關。

pH變化是菌體產酸或產堿的綜合作用結果，可能通過pH變化反應發(fā)酵情況。如灰黃霉素發(fā)酵，乳糖為碳源pH維持在6.0～7.0

葡萄糖為碳源pH下降到3.6，發(fā)酵單位很低三、發(fā)酵pH的確定和控制1、發(fā)酵pH的確定根據(jù)實驗結果確定2、pH控制最適pH在微生物生長和產物形成相互關系：

(1)二者的pH相似且在較寬的內；

(2)生長的pH較寬，而合成的pH較窄；

(3)二者都敏感，但最適點相同；

(4)二者都敏感，但最適點不同。pH的控制方法：1、培養(yǎng)基配比適當，使pH在合適的范圍內變化；2、直接補加酸堿或補料；其中采用補料的方法可以同時實現(xiàn)補充營養(yǎng)、延長發(fā)酵周期、調節(jié)pH和改變培養(yǎng)基性質等幾種目的。補加酸或堿和補料的方式pH和氨氮含量都低時補加氨水pH較高氨氮含量又低時補加硫酸銨溶氧對發(fā)酵的影響及其控制溶氧對發(fā)酵的影響菌體生長、產物合成以及產物的性質1、有時，氧充分促進產物合成，如谷氨酸和金霉素發(fā)酵；2、有時，氧充足會對產物有抑制作用，如維生素B12發(fā)酵。

因此溶氧并非越高越好。氨基酸發(fā)酵對氧的需求分三類：1谷氨酸、精氨酸和脯氨酸，氧必須供應充足，產量才大；2異亮氨酸、賴氨酸和蘇氨酸，供氧充分可獲得最高產量，但供氧受限時，不會有太大影響；3亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸，供氧受限對產物合成有利。發(fā)酵過程中的溶氧變化在一定的發(fā)酵條件下，每種產物發(fā)酵的溶