第二章 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

第一章酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)魏春課程主要內(nèi)容第一章酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(4)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)；酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)；米氏方程；競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；非競(jìng)爭(zhēng)性抑制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；產(chǎn)物抑制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；底物抑制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；酶的失活動(dòng)力學(xué)第二章微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(6)影響微生物生長和代謝的各種因素,微生物反應(yīng)過程計(jì)量學(xué),得率系數(shù)，比生長速率概念及計(jì)算,微生物生長的非結(jié)構(gòu)模型，基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué),產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)第三章微生物反應(yīng)器操作(5)微生物反應(yīng)器操作的分類及比較分批式操作：生長曲線及狀態(tài)方程式流加式操作：流加操作的分類、指數(shù)流加數(shù)學(xué)模型連續(xù)式操作：連續(xù)操作存在的問題及應(yīng)用第四章動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)力學(xué)(2)動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性，植物細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及反應(yīng)動(dòng)力學(xué)第五章生物反應(yīng)器中的傳質(zhì)過程(4)流體流變學(xué)特性,發(fā)酵液的流變學(xué)特性,氧傳遞理論，體積溶氧系數(shù)的測(cè)定,影響kLa的因素及其提高措施第六章生物反應(yīng)器(3)生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)基礎(chǔ)，常見的生物反應(yīng)器,生物反應(yīng)器放大的目的與方法第七章生物反應(yīng)工程領(lǐng)域的拓展(6)超臨界生物反應(yīng)，雙液相生物反應(yīng)、代謝工程、系統(tǒng)生物學(xué)等生物應(yīng)工程領(lǐng)域的拓展介紹引言：堿性果膠酸裂解酶活力測(cè)定取適量稀釋一定倍數(shù)的粗酶液和2ml1%(w/w)果膠溶液(pH9.6)分別置于兩個(gè)試管中，于55℃水浴預(yù)熱5min，然后吸取1ml粗酶液加入到果膠溶液中，并使它們充分混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)10min。取上述反應(yīng)混合物1ml加入9ml0.01mol/lHCl終止反應(yīng)，在235nm處測(cè)定吸光值，以滅過酶活的酶液作為空白對(duì)照。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活單位定義為：每分鐘使果膠裂解產(chǎn)生1μmol的不飽和聚半乳糖醛酸所需的酶量。不飽和聚半乳糖醛酸在235nm處的摩爾吸光系數(shù)為4600Lmol-1cm-1。U=（A/4600）×106×10-3×3×10×（1/10）×n=A×n×(30/46)式中：U-----------酶液的酶活力，U/mLA—————OD值

n————酶液稀釋倍數(shù)2.1酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn)2.1.1酶的基本概念2.1.2酶的穩(wěn)定性及應(yīng)用特點(diǎn)酶是以活力、而不是以質(zhì)量購銷的。酶有不同的質(zhì)量等級(jí)：工業(yè)用酶、食品用酶、醫(yī)藥用酶。酶的實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)注意，沒有必要使用比工藝條件所需純度更高的酶。經(jīng)典酶學(xué)研究中，酶反應(yīng)速率的測(cè)定是在反應(yīng)的初始短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的，并且酶濃度、底物濃度較低，且為水溶液，酶學(xué)研究的目的是探討酶促反應(yīng)的機(jī)制。工業(yè)上，為保證酶促反應(yīng)高效率完成，常需要使用高濃度的酶制劑和底物，且反應(yīng)要持續(xù)較長時(shí)間，反應(yīng)體系多為非均相體系，有時(shí)反應(yīng)是在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。2.2均相酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)2.2.1酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)可采用化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方法建立酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。一步簡(jiǎn)單反應(yīng)（1）對(duì)（1）式從0-t（CA0到CA）進(jìn)行積分可得2.2均相酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)2.2.1酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)可采用化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方法建立酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。對(duì)酶促反應(yīng)，有：

式中，

k：酶促反應(yīng)速率常數(shù)；

r：酶促反應(yīng)速率；

rA：以底物A的消耗速率表示的酶促反應(yīng)速率；

rP：以產(chǎn)物P的生成速率表示的酶促反應(yīng)速率(P指C或D)。CA不斷減少，為使rA恒為正，所以式前要加負(fù)號(hào)對(duì)連鎖的酶促反應(yīng)，

2.2.2單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)2.2.2.1米氏方程根據(jù)酶－底物中間復(fù)合物假說，對(duì)單底物酶促反應(yīng)，其反應(yīng)機(jī)制可表示為：快速平衡法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程：幾點(diǎn)假設(shè)：（1）CS>>CE，中間復(fù)合物ES的形成不會(huì)降低CS。（2）不考慮產(chǎn)物P的可逆反應(yīng)。（3）為快速平衡，為整個(gè)反應(yīng)的限速階段，因此ES分解成產(chǎn)物不足以破壞這個(gè)平衡。解之，得令則根據(jù)假設(shè)建立動(dòng)力學(xué)方程穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程：幾點(diǎn)假設(shè)：（1）CS>>CE，中間復(fù)合物ES的形成不會(huì)降低CS。（2）不考慮這個(gè)可逆反應(yīng)。（3）CS>>CE中間復(fù)合物ES一經(jīng)分解，產(chǎn)生的游離酶立即與底物結(jié)合，使中間復(fù)合物ES濃度保持衡定，即。解之，得令則根據(jù)以上假設(shè)，可建立如下方程組米氏方程rrmaxrmax/2KmCS圖2－1酶濃度一定時(shí)底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響對(duì)米氏方程的討論：當(dāng)CS<<Km時(shí)，，屬一級(jí)反應(yīng)。當(dāng)CS>>Km時(shí)，，屬零級(jí)反應(yīng)。當(dāng)CS＝Km時(shí)，。Km在數(shù)量上等于反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。引言：堿性果膠酸裂解酶活力測(cè)定取適量稀釋一定倍數(shù)的粗酶液和2ml1%(w/w)果膠溶液(pH9.6)分別置于兩個(gè)試管中，于55℃水浴預(yù)熱5min，然后吸取1ml粗酶液加入到果膠溶液中，并使它們充分混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)10min。取上述反應(yīng)混合物1ml加入9ml0.01mol/lHCl終止反應(yīng)，在235nm處測(cè)定吸光值，以滅過酶活的酶液作為空白對(duì)照。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活單位定義為：每分鐘使果膠裂解產(chǎn)生1μmol的不飽和聚半乳糖醛酸所需的酶量。不飽和聚半乳糖醛酸在235nm處的摩爾吸光系數(shù)為4600Lmol-1cm-1[6]。U=（A/4600）×106×10-3×3×10×（1/10）×n=A×n×(30/46)式中：U-----------酶液的酶活力，U/mLA—————OD值

n————酶液稀釋倍數(shù)雙倒數(shù)法(LinewearBurk):對(duì)米氏方程兩側(cè)取倒數(shù)，得

,以作圖，得一直線，直線斜率為，截距為,根據(jù)直線斜率和截距可計(jì)算出Km和rmax。－1／Km1／rmax1／r斜率－Km/rmax1／CS圖2－2雙倒數(shù)法求解Km和rmax

習(xí)題將底物1g/L和酶0.001mol/L加入到酶反應(yīng)器中，經(jīng)反應(yīng)，底物轉(zhuǎn)化率為90%時(shí)，反應(yīng)時(shí)間是多少？已知反應(yīng)速率方程為2.2.2.2抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響

失活作用:

使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用

抑制作用:使酶活力下降，但并不引起酶蛋白變性的作用不可逆抑制競(jìng)爭(zhēng)性抑制可逆抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制

競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制EISESI競(jìng)爭(zhēng)性抑制：抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)，從而阻止底物與酶的結(jié)合。因酶的活性中心不能同時(shí)與抑制劑(I)作用，又與底物(S)作用。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑具有與底物相類似的結(jié)構(gòu)，與酶形成可逆的EI復(fù)合物，但EI不能分解成產(chǎn)物P。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：酶可以同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，兩者沒有競(jìng)爭(zhēng)作用。但是ESI復(fù)合體不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物，因此酶活性降低。競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)機(jī)理：快速平衡法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程：

解之，得，式中:采用穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程：解之，得式中:非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)機(jī)理快速平衡法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程

解之，得式中:穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程：解之，得式中:競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制令可變形為:

可變形為:

令

競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制1／r1／CS1／rmax-1／Km-1／Km’1／r1／CS1／rmax-1／KmCI=0CI

1／rmax’CI=0CI

產(chǎn)物抑制：酶促反應(yīng)中，有時(shí)隨產(chǎn)物濃度提高，產(chǎn)物與酶形成復(fù)合物，阻礙了底物與酶的結(jié)合，從而降低了酶促反應(yīng)的速度。反應(yīng)機(jī)理：

快速平衡法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程:解之,得式中:穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程:解之,得式中:可見,產(chǎn)物抑制屬于競(jìng)爭(zhēng)性抵制底物抑制：對(duì)于某些酶促反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，反應(yīng)速率呈下降趨勢(shì)，稱為底物抑制。CSCSr底物抑制反應(yīng)機(jī)理：快速平衡法推導(dǎo)動(dòng)學(xué)方程：解之,得式中:2.2.3多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)一般的多底物酶促反應(yīng)可表示為：這里討論：雙底物雙產(chǎn)物情況反應(yīng)機(jī)制：關(guān)鍵問題：底物A、B哪個(gè)先和酶結(jié)合？

任何一個(gè)都有可能先與酶結(jié)合（隨機(jī)機(jī)制）A先與酶結(jié)合或B先與酶結(jié)合兩底物同時(shí)與酶結(jié)合（可能性極小）隨機(jī)機(jī)制（分支機(jī)制）EEBEAEABEPQEPEQE（不形成三元復(fù)合物）反應(yīng)模型EAE＋A－A－P＋P＋B－BEQ－Q＋QEEG

（EG：修飾過的酶）簡(jiǎn)單機(jī)制EEAEAB＋A－A＋B－BEPQ－Q＋QEPE－P＋P雙底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

反應(yīng)機(jī)理：解之，得式中：2.3固定化酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)2.3.1固定化酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)2.3.1.1酶的固定化技術(shù)定義酶的固定化技術(shù)是將水溶性的酶分子通過一定的方式，如靜電吸附，共價(jià)鍵等與載體如角叉菜膠、離子交換樹脂等材料制成固相酶的技術(shù)。細(xì)胞的固定化技術(shù):為省去從微生物（或動(dòng)、植物）中提取酶的操作，確保酶的穩(wěn)定性，采用直接固定化微生物細(xì)胞、動(dòng)植物細(xì)胞、組織技術(shù)。

物理吸附法載體結(jié)合法離子結(jié)合法共價(jià)結(jié)合法

交聯(lián)法格子型包埋法微膠囊2.3.1.2酶和細(xì)胞固定化方法交聯(lián)法EOEEOOOE2.3.1.3固定化對(duì)酶性質(zhì)的影響底物專一性的改變穩(wěn)定性增強(qiáng)最適pH值和最適溫度變化動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化2.3.1.4影響固定化酶促反應(yīng)的主要因素

分子構(gòu)象的改變位阻效應(yīng)微擾效應(yīng)分配效應(yīng)（可用Kp定量描述）鏈接擴(kuò)散效應(yīng)

（可定量描述）分配系數(shù)(Kp)鏈接

分配系數(shù)：載體內(nèi)外底物(或其他物質(zhì))濃度之比。

Kp的測(cè)定：已知底物濃度(CS0

)，體積(V0)的溶液中，放入不含底物的一定體積的載體，并保持適宜條件，當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，測(cè)定載體外溶液的底物濃度(Cs)。2.3.2固定化酶促反應(yīng)過程分析2.3.2.1外部擴(kuò)散過程以表面固定化酶為例。CSCSS外擴(kuò)散過程分析外擴(kuò)散速率：

達(dá)到平衡時(shí)，即

酶促反應(yīng)速率：

N,rrmaxNmax0CSSCS(CSS，rout)NmaxN，rrmax0

CSSCS(CSS，rout)Da準(zhǔn)數(shù):當(dāng)時(shí)，過程為外擴(kuò)散控制。當(dāng)時(shí)，過程為反應(yīng)控制。式中:表明C*為Da準(zhǔn)數(shù)的函數(shù)，即(時(shí),)表明為C*的函數(shù)，即

可見，Da準(zhǔn)數(shù)是決定效率因子和比濃度C*的唯一參數(shù)，因而是表征傳質(zhì)過程對(duì)反應(yīng)速率影響的基本準(zhǔn)數(shù)。Da準(zhǔn)數(shù)越小，固定化酶表面濃度越接近于主體濃度CS，越接近于1。Da準(zhǔn)數(shù)越大，固定化酶表面濃度越趨近于零，越小，越趨近于零。

為提高固定化酶外擴(kuò)散效率,應(yīng)設(shè)法減小Da準(zhǔn)數(shù)。減小Da準(zhǔn)數(shù)的措施：

1、降低固定化酶顆粒的粒徑，增大比表面積，但由于粒徑減小會(huì)伴隨壓降增加，因此應(yīng)用中綜合考慮，確定合適的粒徑。

2、使固定化酶表面流體處于湍流狀態(tài)以增大。2.3.2.2內(nèi)部擴(kuò)散過程具有大量內(nèi)孔的球形固定化酶顆粒Rdrr內(nèi)擴(kuò)散效率因子穩(wěn)定狀態(tài)下，對(duì)底物進(jìn)行物料衡算：

流入量－流出量＝反應(yīng)量整理,得兩側(cè)同除

,得當(dāng)反應(yīng)符合米氏方程規(guī)律時(shí)，故,令,,,上式可轉(zhuǎn)化為無因次形式，得邊界條件:,,該微分方程無解析解，只能用數(shù)值法求解。西勒準(zhǔn)數(shù)()

的物理意義是表面反應(yīng)速率與內(nèi)擴(kuò)散速率之比。對(duì)各類反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與固定化酶的形狀，普遍化的的定義式為:引入無因次參數(shù)，則無解析解，只有數(shù)值解。

見教材33頁圖2-10

內(nèi)擴(kuò)散效率因子in是和的函數(shù)。對(duì)in影響不大，影響in的主要參數(shù)是西勒準(zhǔn)數(shù)。如果，則不隨變化，近似等于1，也就是說沒有內(nèi)部傳質(zhì)阻力，若，則，反應(yīng)為內(nèi)擴(kuò)散所限制。

為提高固定化酶內(nèi)擴(kuò)散效率，應(yīng)設(shè)法減小。減小的措施主要是適當(dāng)降低固定化酶顆粒粒徑。外擴(kuò)散過程內(nèi)擴(kuò)散過程Da準(zhǔn)數(shù)是決定外擴(kuò)散效率的唯一