核酸分子雜交

姜雨航王雪憶

核酸分子雜交技術原理及在環(huán)境領域的應用PRESENTERSNAME摘要

簡要介紹在環(huán)境微生物研究中幾種常見的核酸分子雜交技術的原理以及其在環(huán)境微生物監(jiān)測、環(huán)境微生物分類和環(huán)境微生物治理污染中的應用及案例核酸分子雜交技術在研究環(huán)境微生物中發(fā)揮重要作用，大大擴展了環(huán)境微生物學的研究空間。引言

核酸分子雜交是一種基于DNA分子堿基互補配對原則用特異性cDNA探針與待測DNA或RNA形成雜交分子的生物學技術核酸分子雜交具有高度特異性及檢測方法的靈敏性

核酸分子雜交技術一般可分為窄縫雜交法（較少使用）、印跡轉(zhuǎn)移雜交法及原位雜交法CONTENTS熒光原位雜交(FISH)技術

數(shù)量印跡雜交技術印跡轉(zhuǎn)移雜交技術基因芯片技術原理及方法

利用一小段用熒光物質(zhì)標記過的寡核苷酸序列(一般15～30個堿基)為探針，將其投加到環(huán)境樣品中，利用與樣品中同源性微生物靶DNA互補配對特性經(jīng)變性退火復性形成探針與靶DNA的雜交體，在熒光顯微鏡下直接觀察和檢測特定微生物的數(shù)量與分布。

熒光原位雜交(FISH)技術熒光原位雜交(FISH)技術案例FISH技術的應用克服了除磷細菌和某些硝化細菌難以用常規(guī)方法培養(yǎng)等困難。應用ALFIb、HGC和Bet42a探針檢測出的細菌量所占比例在10％～64％；應用MP2和CF探針探測到的細菌含量在4％以下。

在除磷細菌硝化細菌研究中的應用

案例應用FISH技術在EBFR（強化除磷

）工藝中探測到生物除磷的優(yōu)勢種群Rholocyclus。Wagner和BruceER等研究了一套較完善的對硝化細菌檢測的FISH技術。FISH技術也被廣泛地應用于活性污泥系統(tǒng)、膜生物反應器和硝化流化床反應器等污水處理系統(tǒng)中。在環(huán)境微生物功能研究中的應用

FISH應用在對特定功能菌的發(fā)現(xiàn)和分布研究上，用某一類功能酶的保守序列作探針，則對環(huán)境中的功能微生物菌群進行監(jiān)測。用纖維素酶的保守序列作探針，就可以研究環(huán)境中具有纖維素降解能力的微生物的分布。BetheH等用NS0190或NS01225作探針，可檢測出環(huán)境中的氨氧化細菌的存在。熒光原位雜交(FISH)技術數(shù)量印跡雜交技術由其信號的比值來反映某類特定微生物菌群的相對豐度，還可間接反映該類微生物的相對生理活性。應用數(shù)量印跡雜交，可獲得環(huán)境樣品中特定DNA序列的豐度信息。利用通用型探針和專一性探針與環(huán)境樣品中的總DNA和特定類群DNA進行雜交Monique等利用MPH一730(通用型探針)和MPHm一994(專一性探針)兩種探針以測定噬甲基菌屬(Methylophaga)和海洋中的噬甲基菌屬的相對豐度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)噬甲基菌屬在海洋沉積物中廣泛存在

從環(huán)境樣品中提取細菌總DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶切割、電泳，將條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上與DNA或RNA探針雜交，從雜交條帶的數(shù)量推知功能微生物菌群的豐度

印跡轉(zhuǎn)移雜交包括Southern和Northern印跡雜交技術，應用于樣品中的DNA和RNA樣品，以前者在環(huán)境微生物研究中應用較廣

印跡轉(zhuǎn)移雜交技術Southern印跡雜交技術原理從環(huán)境樣品中提取細菌總DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶切割、電泳，將條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上與DNA或RNA探針雜交，從雜交條帶的數(shù)量推知功能微生物菌群的豐度

印跡轉(zhuǎn)移雜交包括Southern和Northern印跡雜交技術，應用于樣品中的DNA和RNA樣品，以前者在環(huán)境微生物研究中應用較廣

印跡轉(zhuǎn)移雜交技術Southern印跡雜交技術原理Northern技術是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法被測樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，進行雜交反應，以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小將耐藥基因?qū)胄∈蠊撬杓毎?/p>

,能使之獲得對化療藥物的抵抗,骨髓造血和免疫功能得到一定程度的保護。利用含雙順反子的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將醛脫氫酶基因和多藥耐藥基因?qū)爰毎?并在體外獲得有效表達。

印跡轉(zhuǎn)移雜交技術Northern印跡雜交技術原理應用基因芯片是將大量核苷酸探針以點陣列方式高密度地排列于特定的支持物上．如硅片、玻片、薄膜等，與樣品DNA雜交后通過激光共聚焦等技術分析靶DNA的存在和相對含量的現(xiàn)代分子生物學方法將某一分類單元的特異DNA片段或功能基因的保守片段作為探針整合在芯片上，則可以對環(huán)境樣品中的微生物結(jié)構與功能進行監(jiān)測分析，如16sRNA基因芯片。基因芯片技術方法原理基因芯片技術應用一應用二應用三生化循環(huán)過程關鍵酶(如去硝化)的功能基芯片，可用于檢測自然環(huán)境中微生物群落的生理地位和功能由含有源于核糖體核酸(rRNA)基因探針的系統(tǒng)發(fā)育的寡核苷酸芯片，應用于微生物群落的系統(tǒng)發(fā)育分析構建純培養(yǎng)微生物群落基因組芯片，根據(jù)可培養(yǎng)成分反映微生物群落。結(jié)語彌補了傳統(tǒng)方法對于難以培養(yǎng)環(huán)境微生物研究的缺陷，更為客觀地反映微生物在自然或人工系統(tǒng)中的狀況核酸分子雜交技術直接在樣品和微生物群落、生理功能特征兩者間構建了信息橋梁在包括環(huán)境微生物污染治理和種群監(jiān)測、分類尤其是環(huán)境微生物功能的研究等環(huán)境科學領域中應用日益廣泛為環(huán)境監(jiān)測和污染治理提供