常見病原微生物的檢測

常見病原微生物的檢測第一頁，共七十八頁，2022年，8月28日

兔血漿制備:無菌采取兔心臟血,以1份滅菌的3.8%枸櫞酸鈉液抗凝劑加4份兔血的比例充分混勻,離心,吸取上清液即為原兔血漿,分裝成1ml/支或0.5ml/支;另用滅菌生理鹽水稀釋兔血漿,制成4倍稀釋血漿(以下簡稱為稀釋兔血漿),分裝同上,于-18℃以下冰凍保存,供試驗

遺留問題第二頁，共七十八頁，2022年，8月28日2第一節(jié)炭疽桿菌（一）炭疽桿菌（Bacillusanthraci）屬于需氧芽胞桿菌屬，能引起羊、牛、馬等動物及人類的炭疽病。炭疽桿菌曾被帝國主義作為致死戰(zhàn)劑之一。（一）生物學(xué)性狀1.菌體粗大，排列似竹節(jié)狀，無鞭毛，無動力，革蘭氏染色陽性，本菌在氧氣充足，溫度適宜（25～30℃）的條件下易形成芽胞。第三頁，共七十八頁，2022年，8月28日32.在活體或未經(jīng)解剖的尸體內(nèi)，則不能形成芽胞。芽胞呈橢圓形，位于菌體中央，其寬度小于菌體的寬度。3.形成莢膜是毒性特征。4.炭疽桿菌受低濃度青霉素作用，菌體可腫大形成園珠，稱為“串珠反應(yīng)”。這也是炭疽桿菌特有的反應(yīng)。第四頁，共七十八頁，2022年，8月28日41.本菌專性需氧或兼性厭氧，在普通培養(yǎng)基中易繁殖。2.最適溫度為37℃，最適pH為7.2～7.43.在瓊脂平板培養(yǎng)24小時，粗糙菌落。菌落呈毛玻璃狀，邊緣不整齊，呈卷發(fā)狀，有一個或數(shù)個小尾突起，這是本菌向外伸延繁殖所致。（二）培養(yǎng)特性第五頁，共七十八頁，2022年，8月28日54.在5～10%綿羊血液瓊脂平板上，菌落周圍無明顯的溶血環(huán)，但培養(yǎng)較久后可出現(xiàn)輕度溶血。菌落有粘性，用接種針鉤取可拉成絲，稱為“拉絲”現(xiàn)象。5.在普通肉湯培養(yǎng)18～24小時，管底有絮狀沉淀生長，無菌膜，菌液清亮。有毒株在碳酸氫鈉平板，20%CO2培養(yǎng)下，形成粘液狀菌落（有莢膜），而無毒株則為粗糙狀。第六頁，共七十八頁，2022年，8月28日6（三）抵抗力繁殖體抵抗力不強(qiáng)，易被一般消毒劑殺滅，而芽胞抵抗力強(qiáng)，在干燥的室溫環(huán)境中可存活數(shù)十年，在皮毛中可存活數(shù)年。牧場一旦被污染，芽胞可存活數(shù)年至數(shù)十年。煮沸10分鐘或干熱140℃3小時可將芽胞殺死。炭疽芽胞對碘特別敏感，對青霉素、鏈霉素、卡那霉素等高度敏感。第七頁，共七十八頁，2022年，8月28日7一）致病性人類主要通過工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)而感染。機(jī)體抵抗力降低時，接觸污染物品可發(fā)生下列疾?。?．皮膚炭疽，最常見，多發(fā)生于屠宰或毛刷工人及飼養(yǎng)員。2．縱隔障炭疽，少見。由吸入病菌芽胞所致，多發(fā)生于皮毛工人，病死率高。病初似感冒，進(jìn)而出現(xiàn)嚴(yán)重的支氣管肺炎，可在2～3天內(nèi)死于中毒性休克。二、致病性與免疫性第八頁，共七十八頁，2022年，8月28日83．腸炭疽，由食入病獸肉制品所致，以全身中毒癥狀為主，并有胃腸道潰瘍、出血及毒血癥，發(fā)病后2～3日內(nèi)死亡。上述疾病若引起敗血癥時，可繼發(fā)“炭疽性腦膜炎”。炭疽桿菌的致病性取決于莢膜和毒素的協(xié)同作用。第九頁，共七十八頁，2022年，8月28日9（二）免疫性注射炭疽外毒素中保護(hù)性抗原于機(jī)體，能形成抗毒素免疫，對受染炭疽有保護(hù)作用。但單純的莢膜抗體對機(jī)體沒有保護(hù)作用。病后可獲較強(qiáng)的免疫力。第十頁，共七十八頁，2022年，8月28日10三、微生物學(xué)檢查1.采集皮膚炭疽的膿液、滲出物，腸炭疽的糞便以及病人的的血液等送檢，獸尸禁止解剖，可割取耳朵或舌尖一片送檢。2.將標(biāo)本直接涂片，沙黃莢膜染色鏡檢，觀察形態(tài)及莢膜特征，可以初步幫助診斷。第十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日113.確診應(yīng)進(jìn)行血平板分離培養(yǎng)，37℃孵育12～15小時，鉤取可疑菌落，進(jìn)行青霉素串珠試驗，噬菌體裂解試驗，碳酸氫鈉平板二氧化碳培養(yǎng)。莢膜腫脹試驗和小白鼠致病力試驗等與其他需氧芽胞桿菌進(jìn)行鑒別確定。第十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日12四、特異防治1.預(yù)防人類炭疽首先應(yīng)防止家畜炭疽的發(fā)生。家畜炭疽感染消滅后，人類的傳染源也隨之消滅。2.目前我國使用的炭疽活疫菌，作皮上劃痕接種，免疫力可維護(hù)半年至一年。青霉素是治療炭疽的首選藥物，對腸道及吸入性炭疽治療困難，有條件的可用抗血清。第十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日13五、檢測方法1.環(huán)狀沉淀反應(yīng)2.噬菌體裂解實驗3.莢膜熒光抗體檢測4.質(zhì)譜分析法第十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日14第一節(jié)布魯氏桿菌（二）本菌屬初次分離培養(yǎng)時多呈小球桿狀，毒力菌株有莢膜，經(jīng)傳代培養(yǎng)漸呈桿狀，革蘭氏染色陰性。我國流行的是羊、牛、豬布氏桿菌一、生物學(xué)性狀1.形態(tài)染色第十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日15本菌為嚴(yán)格需氧菌；牛布氏桿菌在初次分離時，需在5～10%CO2環(huán)境中才能生長，最適溫度37℃，最適的pH6.6～7.1，營養(yǎng)要求高，生長時需硫胺素，煙草酸和生物素，泛酸鈣等，實驗室常用肝浸液培養(yǎng)基或改良厚氏培養(yǎng)基。此菌生緩慢，培養(yǎng)48小時后才出現(xiàn)透明的小菌落，雞胚培養(yǎng)也能生長。

2.培養(yǎng)特性第十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日16在自然界中抵抗力較強(qiáng)，在病畜的臟器和分泌物中，一般能存活4個月左右，在食品中約能生存2個月。對低溫的抵抗力也強(qiáng)，對熱和消毒劑抵抗力弱。對鏈霉素、氯霉素和四環(huán)素等均敏感。

3.抵抗力第十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日17本菌侵入人體后，被吞噬細(xì)胞吞噬，由于本菌具有莢膜，能抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬消毀，并能在該細(xì)胞內(nèi)增殖。反復(fù)出現(xiàn)菌血癥。由于內(nèi)毒素的作用，病人出現(xiàn)發(fā)熱、無力等中毒癥狀，血流中細(xì)菌逐步消失，體溫也逐漸消退。細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)繁殖至一定程度時，再次進(jìn)入血流又出現(xiàn)菌血癥，體溫再次上升，反復(fù)呈波浪熱型。二、致病性和免疫性第十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日18

人感染布氏桿菌表現(xiàn)乏力，全身軟弱，食欲不振，失眠，咳嗽，有白色痰，可聽到肺部干鳴，多呈波浪熱，也有稽留熱、不規(guī)則熱或不發(fā)熱。盜汗或大汗，一個或多個關(guān)節(jié)發(fā)生無紅腫熱的疼痛，肌肉酸痛，由于關(guān)節(jié)和肌肉疼痛難忍，即使不發(fā)燒也不能勞動，成為能吃不能活懶漢，故該病又被稱作"懶漢病"。

病灶發(fā)生在生殖器官，影響生育，嚴(yán)重者可引起死亡。三、主要癥狀第十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日19

本菌傳染性大，要注意防止實驗室污染。（一）分離培養(yǎng)急性期采集血液，慢性期采取骨髓，接種于雙相肝浸液培養(yǎng)基（一半斜面，一半液體）置37℃10%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，每隔2天檢查一次，如無細(xì)菌生長則搖蕩培養(yǎng)基，使液體浸過斜面上，有細(xì)菌生長，可依鑒定項目確定是否為布氏桿菌。經(jīng)一月培養(yǎng)無細(xì)菌生長，可報告陰性。

四、微生物學(xué)檢驗第二十頁，共七十八頁，2022年，8月28日20（二）血清學(xué)檢查通常作凝集試驗，判定凝集效價1：50可疑，1：100以上為陽性。效價增高4倍以上時，更有診斷價值。（三）酶聯(lián)免疫吸附檢測第二十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日21（四）PCR檢測此法敏感、特異、快速，實時熒光定量PCR已用于布氏桿菌特異性基因的檢測，即在PCR反應(yīng)體系中加熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累，實時監(jiān)測整個過程。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可進(jìn)行定量。第二十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日22第一節(jié)結(jié)核分枝桿菌（三）簡介第二十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日23（1）形態(tài)與染色一、生物學(xué)性狀第二十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日24（2）培養(yǎng)特性第二十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日25第二十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日26（3）生化反應(yīng)第二十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日27（4）抵抗力第二十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日28（5）變異性第二十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日29二、致病性第三十頁，共七十八頁，2022年，8月28日30（一）致病物質(zhì)第三十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日311.莢膜第三十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日32①梭狀因子④蠟質(zhì)D③硫酸腦苷脂②磷脂2.脂質(zhì)第三十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日33第三十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日343.蛋白質(zhì)第三十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日354.多糖質(zhì)第三十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日365.核酸第三十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日37（二）所致疾病第三十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日38三、檢測方法檢測方法：免疫學(xué)和細(xì)菌學(xué)檢測⑴根據(jù)感染部位選擇樣品制作標(biāo)本⑵分離培養(yǎng)⑶動物試驗⑷快速診斷第三十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日39是人類霍亂的病原體。引起腸道傳染病?；魜y是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病。曾在世界上引起多次大流行，主要表現(xiàn)為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚高。屬于國際檢疫甲類傳染病。第一節(jié)霍亂弧菌（V.cholerae）（四）第四十頁，共七十八頁，2022年，8月28日40兩個生物型：古典生物型（霍亂的病原體）和埃爾托生物型（副霍亂的病原體）第四十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日41流行情況第四十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日42一、生物學(xué)性狀形態(tài)與染色

1.呈弧形或逗點(diǎn)狀；排列成魚群狀2.革蘭陰性；無芽孢，無莢膜3.有單鞭毛，運(yùn)動活潑，呈穿梭樣或流星樣4.有菌毛第四十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日43培養(yǎng)特性1.營養(yǎng)要求不高；2.兼性厭氧菌；3.生長繁殖溫度范圍廣（18-37℃）；4.嗜堿---堿性蛋白胨(pH8.8-9.0):初次分離培養(yǎng)

TCBS平板：黃色菌落5.可在無鹽環(huán)境中生長

第四十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日44抵抗力1.對熱、干燥、日光，化學(xué)消毒劑和酸均很敏感

2.耐低溫，耐堿。

四怕：怕醋、怕煮、怕曬、怕藥。

怕熱不怕冷怕干不怕濕怕酸不怕堿怕咸不怕淡第四十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日45毒

素

霍亂腸毒素(CT)：前噬菌體基因編碼

小帶聯(lián)結(jié)毒素Zot增加腸黏膜通透性

副霍亂腸毒素Ace腸段積液侵襲力鞭

毛菌毛致病物質(zhì)第四十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日46CT的結(jié)構(gòu)B亞單位：

與小腸粘膜上皮細(xì)胞GM1神經(jīng)節(jié)苷脂受體結(jié)合；由1個A亞單位和5個B亞單位構(gòu)成的多聚體，不耐熱。（前噬菌體基因編碼）1A+5B第四十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日47霍亂典型臨床特征患者出現(xiàn)上吐下瀉，瀉出物呈“米泔水樣”。并發(fā)癥有血容量減少，

循環(huán)衰竭及腎功能衰竭，導(dǎo)致尿閉、電解質(zhì)、酸堿平衡失調(diào)導(dǎo)致肌肉痙攣。

第四十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日48免疫性感染后可獲牢固免疫力；再感染少見局部黏膜免疫；抗菌抗體（O）；抗毒素抗體（B）

O1群與O139群不存在交叉免疫保護(hù)作用。第四十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日49⑴微生物學(xué)檢查a.采集樣品b.鏡檢c.分離培養(yǎng)并生化反應(yīng)和凝集反應(yīng)⑵PCR檢查⑶Southernblot檢測檢驗方法第五十頁，共七十八頁，2022年，8月28日50第二節(jié)食物傳播的病毒及其檢驗1.朊病毒2.禽流感病毒3.甲型肝炎病毒第五十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日51一、朊病毒及其檢驗

朊病毒(prion)----傳染性蛋白粒子/朊粒/朊毒體，是一種不同于細(xì)菌、病毒或類病毒的在分類上尚未定論的病原因子，其本質(zhì)為由正常宿主細(xì)胞基因編碼的、構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，稱為朊蛋白(prionprotein,PrP)，目前尚未檢出任何核酸成分，是人和動物的傳染性海綿狀腦病（TSEs)的病原體。

第五十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日52

（一）形態(tài)與結(jié)構(gòu)

prion是一種不含核酸和脂類的疏水性糖蛋白，分子量為27～30×103，因此又稱為PrP27～30。大小30-50nm，電鏡下看不到病毒粒子，負(fù)染后看到聚集而成的棒狀體，大小10-250nm×100-200nm。其能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，無免疫性，不誘發(fā)抗體。

一、生物學(xué)特性第五十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日531.細(xì)胞朊病毒蛋白(cellularPrP,PrPC)：具有42%的α-螺旋，3%的β折疊。存在于正常組織及感染動物的組織中，是正?；虻漠a(chǎn)物，通常情況下是無害的，對蛋白酶K敏感。2.騷擾型朊病毒蛋白(scrapieprionprotein,PrPsc)：α-螺旋占30%，β折疊高達(dá)43%，僅存在于感染動物的組織中，與致病和傳染有關(guān)，對蛋白酶K有抗性。兩種不同的分子構(gòu)型第五十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日54朊病毒顆粒對一些理化因子的抵抗力之強(qiáng)，大大高于已知各類微生物和寄生蟲。

1.傳染源：感染朊毒體的人和動物。2.傳染途徑：消化道傳播。醫(yī)源性傳播：腦外科手術(shù)、器官移植等遺傳。（二）抵抗力

（三）致病性第五十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日55瘋牛?。号：＞d狀腦病。病牛臨床表現(xiàn)為步態(tài)不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)、搔癢、煩躁不安等神經(jīng)癥狀。綿羊癢?。核茄虻囊环N慢性致死性疾病，病羊具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性、劇癢、共濟(jì)失調(diào)、高死亡率等特點(diǎn)?？?雅氏病：人的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。其臨床癥狀和病理組織學(xué)變化與瘋牛病、綿羊癢病十分相似。

3.導(dǎo)致疾病第五十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日56共同特征：潛伏期長（可達(dá)數(shù)年至數(shù)十年），一旦發(fā)病即呈慢性進(jìn)行性發(fā)展，最終死亡。

第五十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日57PrPC轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSC是疾病發(fā)生的基本條件，PrPSC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)聚集，導(dǎo)致神經(jīng)元的破壞。腦組織病理學(xué)特點(diǎn)：中樞神經(jīng)細(xì)胞空泡化、彌漫性神經(jīng)細(xì)胞缺失、膠質(zhì)細(xì)胞增生、淀粉樣斑塊形成、腦組織海綿狀改變；PrPSc聚集。

4.發(fā)病機(jī)理

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1.免疫組化技術(shù)

取可疑患者的腦組織或非神經(jīng)組織切片，經(jīng)脫水性或水解性高壓消毒、甲酸和硫氰酸胍處理，使其感染性消失并破壞PrPC后，再用單克隆抗體檢測對上述處理有抗性的PrPSC。

朊病毒的檢驗

第五十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日59組織印跡法檢測PrPSC是一種簡單而敏感的診斷方法。方法：首先將待測的樣品印跡在固相載體——硝酸纖維素膜上，用病毒的家兔特異性抗體（IgG）與吸附在固相載體上的病毒進(jìn)行特異性反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的羊抗兔第二抗體進(jìn)行反應(yīng)，最后用酶的反應(yīng)底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色的變化，確定病毒的感染程度。

2.免疫印跡技術(shù)第六十頁，共七十八頁，2022年，8月28日60

從病人外周血白細(xì)胞中提取DNA，對20號染色體prion基因進(jìn)行分子遺傳學(xué)分析。3.基因分析第六十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日61第一節(jié)禽流感病毒（二）禽流感是禽流行性感冒（Avian

Influenza，AI）的簡稱，這是一種由甲型流感病毒的一種亞型引起的傳染性疾病綜合征，被國際獸疫局定為Ａ類傳染病，又稱真性雞瘟或歐洲雞瘟。

第六十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日621.形態(tài)學(xué)特點(diǎn)禽流感病毒是正粘病毒，流感病毒屬的一個成員。禽流感病毒具有A型抗原，屬于A型流感病毒，列為禽流感病毒類。一、生物學(xué)特性

第六十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日63流感病毒分為三個不同的抗原型，即A、B、C三型。其中B、C兩型僅能對人致病，A型可對人、豬、馬和禽致病。依據(jù)病毒表面的兩種糖蛋白血凝素〈HA〉和神經(jīng)氨酸酶〈NA〉可將A型流感病毒分成若干亞型。目前已有15種HA（H1-H15)和9種NA(N1-N9)。2.禽流感病毒的分型第六十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日64對熱的抵抗力較低，65℃30分鐘，100℃2分鐘即滅活，普通消毒劑能很快將它殺死。低溫凍干或甘油保存可使病毒存活多年。

3.抵抗力第六十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日65禽流感在家禽中以雞和火雞及某些野禽的易感性最高，并呈急性致死性傳染病。鴨、鵝及其它水禽類的易感性較差，多為隱性感染或帶毒，有時也能大批死亡。鴿子可帶毒，但很少自然發(fā)病。4.流行病學(xué)第六十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日66禽流感的癥狀極為復(fù)雜，有最急性、急性、亞急性及隱性感染等。℃，精神沉郁、拒食、病雞很快陷于昏睡狀態(tài)，有些頸部出現(xiàn)向后扭轉(zhuǎn)的神經(jīng)癥狀。病雞多呈急性死亡，有的也可能出現(xiàn)呼吸道癥狀，咳嗽、打噴嚏，氣管出現(xiàn)咯音，流淚等癥狀，羽毛蓬松，產(chǎn)蛋率下降，死亡率高低不等。5.臨床癥狀和病理變化第六十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日67

1.病原的分離病原的分離和鑒定可以從活體或尸體分離病毒。用棉拭子法?？蓮幕铙w的氣管和泄殖腔中分離到病毒，可用不同大小的棉拭子擦取氣管或泄殖腔，然后將拭子放入滅菌的保存液〈25－50%甘油鹽水、肉湯或1000u/ml青霉素和10mg/mL鏈霉素的細(xì)胞維持液〉中。病料的采取時間：一般在感染初期或發(fā)病急性期采取。如轉(zhuǎn)為后期則因機(jī)體已形成足夠的抗體而不易分離到病毒.二、診斷第六十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日68通常用雞胚來進(jìn)行。接種9-10日齡雞胚尿囊腔，繼續(xù)孵育48-72h。如材料中含有病毒時，則接種48h雞胚死亡，但在多數(shù)情況下初代分離時雞胚多不死，為此需將經(jīng)72h未死的雞胚置冰箱內(nèi)凍死后，收集尿囊液作第二代接種。如第二代接種的雞胚仍不死亡，即可判定分離病毒為陰性。2.病毒分離第六十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日69三、介紹高致病性禽流感的其他知識鑒定高致病性禽流感的標(biāo)準(zhǔn):

按照國際標(biāo)準(zhǔn)，能引起接種雞死亡75％以上的分離株，是高致病性毒株。盡管接種雞是確定致病的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，但它不能反應(yīng)致死率小于75%的H5或H7亞型病毒的潛在致病力。因此0IE(國際獸疫局〉根據(jù)科學(xué)家的建議，推出新鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

第七十頁，共七十八頁，2022年，8月28日70

1.任何分離到A型流感病毒，用0.2mL1:10稀釋的無菌尿囊液靜脈或肌肉注射8只4－8周齡易感雞，10天內(nèi)的死亡率不低于75%。

第七十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日712.對所有低致病的H5、H7毒株，血凝素切割位點(diǎn)的氨基酸序列與高致病性禽流感病毒一致。

3.H5、H7以外的A型流感病毒，可以致死1－5只雞，在缺乏胰蛋白酶的情況下,能在細(xì)胞上生長形成蝕斑。

第七十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日72禽流感的傳播途徑是什么？禽流感的傳播：有病禽和健康禽直接接觸；病毒污染物間接接觸。禽流感病毒存在于病禽和感染禽的