植物種質(zhì)資源離體保存

第十二章植物種質(zhì)資源離體保存植物種質(zhì)資源離體保存的概念和意義保持生物多樣性(biodiversity)是一個國際性備受重視的問題。被喪失，而種質(zhì)資源是植物育種工作的根底，因此，搜集和保存種質(zhì)資源已受到世界各國的重視。(insituconservation)和非原生境保存(exsituconservation)，后者(試管)保存等。原生境保存和移地保存固然有其明顯的重要性，但要保存大量種質(zhì)，則需消耗巨大的人力、物力和土地，在實際上很難實施，而且易受自然災(zāi)難、蟲害和病害的侵襲，造成植物存；③承受無性生殖來保持其優(yōu)良性狀的植物(如很多果樹)，用種子生殖后代會發(fā)生變異；④〔依據(jù)枯燥對種子生命力的12這類種子也不能在低溫下貯藏。生長在熱帶的藤黃科、山欖科、龍腦香科、番荔枝科、無患子科、馬錢科等植物都是這類種子〕植物不宜用種子保存或保存難度很大；⑤易遭自然災(zāi)難攻擊而喪失。2060種質(zhì)資源的離體保存(germplasmconservationinvitro)是指對離體培育的小植株、在超低溫保存中，也常常直接承受植物莖尖或分生組織、胚、花粉等材料作為保存材料。離體種質(zhì)保存有以下優(yōu)點：①所占空間少，節(jié)約大量的人力、物力和土地；②便于種質(zhì)資源的溝通利用；③需要時，可以用離體培育方法很快大量生殖；④避開自然災(zāi)難引起的種質(zhì)丟失。固然，離體種質(zhì)保存也有一些值得留意的缺乏之處：①對于限制或延緩生長的處理，需定期轉(zhuǎn)移，連續(xù)繼代培育；②易受微生物污染化和再生力量的逐漸喪失。70年月以來，人們把冷凍生物學(xué)(cryobiology)和植物離體微繁結(jié)合起來，進展了離體種質(zhì)資源冷凍保存(freezingconservationinvitro)或超低溫保存(cryopreservation善，已經(jīng)或正在建立離體種質(zhì)保存庫。植物種質(zhì)資源離體保存的方法限制生長保存限制生長保存利用限制離體培育物的生長速度來保存種質(zhì)的方法慢的速度生長。這樣，轉(zhuǎn)移繼代的間隔時間可延長。但應(yīng)用這些方法細胞學(xué)、遺傳學(xué)和生產(chǎn)性狀的鑒定。低溫保存法低溫保存(lowtemperatureconservation)是限制生長應(yīng)用最廣l～9℃(10～20℃)下培育，并常常同時提高培育基的滲透壓。在這種條件下，培育物的生長受到限制，繼代培育時間間隔數(shù)個月至1溫(正常)下培育，即可快速恢復(fù)生長。高滲透壓保存法2％～410％左右，就可到達抑制培育物生長的目的。提高培育基的滲透壓還可承受外加甘露醇、山梨醇等惰性物質(zhì)2％～32％～5％的甘露醇處83％甘露醇，均可高滲透壓。生長抑制劑(或延緩劑)保存法長抑制劑—ABARNA制DNA生長抑制劑。降低氧分壓保存法

)、多效唑等人工合成的植物9壓太低，則會產(chǎn)生毒害作用?？菰锉４娣ㄋ巧顒拥幕|(zhì)，降低培育物水分，其生命活動就能延緩，4～7d)，然后置于加生長延緩劑或限制蔗糖的條件下保存。在不含蔗糖2恢復(fù)生長快，適于現(xiàn)代化種質(zhì)庫的治理。值得一提的是，離體保存植物種質(zhì)時，不同植物、不同基因型或同一品種的不同材料，所承受的上的保存方法結(jié)合使用，更有助于延長不同植物的保存年限。超低溫保存植物超低溫種質(zhì)保存的概念2070和Street氮中保存后能恢復(fù)生長，從而導(dǎo)致了種質(zhì)資源超低溫保存法的進展。法處理后在超低溫(一196℃液氮)條件下進展保存的方法。目前，承受莖尖、獼猴桃莖尖、薯蕷莖尖、馬鈴薯莖尖、蘋果根尖、甘薯莖尖等。超低溫保存的根本原理氮中(－196因而排解了遺傳性狀的變異，同時保存了細胞的活力和形態(tài)發(fā)生潛能。低溫冰凍過程中假設(shè)生物細胞內(nèi)水分結(jié)冰細胞構(gòu)造就會遭到不行逆的破壞導(dǎo)致細胞和組織死亡植物材料在超低溫條件下之所以可以長期保存并能在離開保存環(huán)境后正常進展細胞分裂和分化就是在冰凍過程中避開了細胞內(nèi)水分結(jié)冰并且在解凍過程中防止細胞內(nèi)水分的次生結(jié)冰而到達植物材料保存目的但是植物細胞含水量比動物細胞高在冷凍(freezing)過程中會有冰晶形成和過度脫水，在解凍(thawing)過程中也會重形成冰晶和患病溫度沖擊(thermalshock)，保存難度大。假設(shè)直接將保存材料投放到液氮中，細胞和組織由于細胞內(nèi)水分結(jié)冰，引起組織和細胞死亡。因此，植物種質(zhì)超低溫保存必需實行如下措施：①選擇細胞內(nèi)自由水少抗凍力量強的植物材料；②實行一些預(yù)處理措施，提高植物材料的抗凍力量；③在冷凍過程中盡量削減冰晶的形成避開組織細胞過度脫水；④在解凍過程中避開冰晶的重形成以及溫度沖擊導(dǎo)致的滲透沖擊 (osmoticstress)等。超低溫保存的根本程序料(培育物)的選取、材料的預(yù)處理、冷凍處理、冷凍貯存、解凍、再12－1)。假設(shè)操作不當，保存就會失敗，因此，必需把握好整個技術(shù)程序的各個環(huán)節(jié)。12－1植物離體材料超低溫保存的根本程序植物材料(培育物)選取已經(jīng)爭論或應(yīng)用過的植物材料或培育物主要有三類：①愈傷組幼齡植株。凍性強的離體培育物作為保存材料是超低溫保存離體種質(zhì)成功的關(guān)遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象，在現(xiàn)有的技術(shù)條件下，尚無有效的掌握措施，并且用莖尖、腋芽原基、胚、幼齡植株等有組織構(gòu)造的離體材料，由于其遺傳穩(wěn)定性好，易于再生，且細胞體積小、液泡小，含水量較低，細保存材料。生長。幼小的球形胚比老齡胚存活率高。材料預(yù)處理的比例。由于分裂細胞小，胞內(nèi)自由水含量少，在冷凍過程中細胞內(nèi)不易有大冰晶形成，細胞不易受害。的離體培育物進展低溫預(yù)處理和低溫預(yù)處理是將離。冷凍前或冷凍期間，由于細胞脫水，導(dǎo)致細胞內(nèi)可溶物的濃度在(DMSO)、脯氨酸、糖類、聚乙二醇、乙酰胺、糖醇和福美氧化硫等。對植物來說，DMSO是最好的防5％～8％。解凍后的存活率。愈傷組織來說，加速繼代可提高小細胞的頻率。然后，把莖尖或細胞0℃的條件下培育數(shù)日。冷凍處理(slowcoolingmethod)(fastcoolingmethod)、預(yù)凍法(pre-freezingmethod)和干凍法(dry-freezingmethod)。慢凍法個低溫的過程。慢凍法是分步進展的，其根本操作為：先以1～5℃-30～-40℃或-1001h196℃)保存。形成冰晶，即使是體積較大、含水量較高的植物材料，也可以得到較浮培育物尤其適用，但要求嚴格掌握降溫速度。快凍法快凍法是對預(yù)處理過的材料以100～1000℃／min196℃成的冰晶體沒到達使細胞致死的程度。一些植物的離體種質(zhì)，如草莓、馬鈴薯、奢蕷、蘋果根尖等。預(yù)凍法預(yù)凍法是將植物組織放人液氮前，先經(jīng)幾個階段的預(yù)凍，如-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-70℃，然后再轉(zhuǎn)入-196℃液氮中。此法已較少使用。干凍法干凍法是把樣品放人烘箱內(nèi)或真空中，使其脫水(dehydration)，提高其抗凍性，然后再放人液氮中保存的方法。不活率。冷凍貯存在冷凍貯存期間，由于液氮在不斷揮發(fā)，所以，必需定時補充液-196℃下的材料要長期貯40002ml20～25L隨著貯存時間的延長，細胞活力會有肯定的下降。因此，這項技術(shù)仍需改進。解凍。解凍的速度是解凍技術(shù)的關(guān)鍵，解凍可分為快速解凍(fastthawing)和慢速解凍(slowthawing)兩種方法。解凍的速度慢，細胞內(nèi)簡潔發(fā)生再結(jié)晶，導(dǎo)致細胞死亡；速度快，再結(jié)晶的過程來不及發(fā)生，細胞存活率高。快速解凍法快速解凍法就是把冷凍的材料取出后，快速放入35～40℃(該溫度下解凍速度一般為500～700℃／min)溫水浴。慢速解凍法02～3℃的低溫下漸漸溶化。少數(shù)超低溫保存的材料只有承受慢速解凍才能存活，料死亡。因此，解凍速度的選擇應(yīng)參考冷凍速度。2.2.3.5進展培育，應(yīng)將融解后的樣品直接置于瓊脂培育基上培育，l～2胞在冷凍過程中滲漏出來的某些重要物質(zhì)被洗掉了的原因。當重培育曾在-196℃GA3

以后，冷GA

，莖尖則3GA3

就能直接長成小植株。此外，參加活性炭可以顯著提高經(jīng)過冷凍和解凍的胡蘿卜試管苗的總的存活率。100％，因而需要測定培育物活力，以剔除沒有生活力的培育物。測定方法有FDA〔熒光素雙醋酸酯〕染色法、TTC〔氯化三苯基四氮唑〕復(fù)原法、EvansBlue20％～80％之間。(2℃)熬煉過的金冠和富士蘋果的莖尖，超低溫保存后成活率可達80Diosc