十六章-抗生素藥物的分析

第十六章抗生素類藥物分析第一節(jié)概述一、抗生素的定義及特點◆低化學純度－同系物多、異構體多、降解物多◆活性組分的變異性－生產過程中條件的變化◆不穩(wěn)定性－不穩(wěn)定性結構

是指“生物在其生命活動中產生的，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物機能的化學物質的總稱”抗生素的分類β－內酰胺類抗生素四環(huán)素類抗生素氨基糖苷類抗生素大環(huán)內酯類抗生素多烯大環(huán)類抗生素－制菌霉素、兩性霉素多肽類抗生素－放線菌素、多黏菌素酰胺醇類抗生素－氯霉素抗腫瘤類抗生素其他抗生素二、抗生素類藥物的分類按化學結構分三、抗生素類藥物的細菌耐藥性三、抗生素類藥物的細菌耐藥性◆1、耐藥性的種類固有耐藥性：天然耐藥性，由細菌染色體基因決定獲得性耐藥性：◆2、耐藥的機制（1）產生滅活酶，使抗菌藥失活如β-內酰胺酶（2）抗菌藥物作用靶位改變（3）降低細菌外膜通透性（4）影響主動流出系統(tǒng)四、抗生素藥物的質量分析鑒別試驗㈠1、官能團的顯色反應－特殊基團的反應2、光譜法－特征吸收3、色譜法－保留行為4、生物學方法－抗菌能力㈡檢查1、影響產品穩(wěn)定性的檢查項目－水份、酸堿度等2、控制有機和無機雜質的檢查項目3、與臨床安全性密切相關的檢查項目－異常毒性、熱原等4、其他檢查項目－其他共存組分㈢含量或效價測定1、微生物檢定法比濁法管碟法－抑菌圈效價:是指每ml或每mg中含有某種抗生素有效成分的多少U/mg是以抗生素對微生物的殺傷或抑制程度為指標來判斷效價的一種方法方法靈敏度高、需用量少適用范圍廣－純品、不純品、已知的和新的可一次測定同類型抗生素的總效價－無需分離純化與臨床的應用要求一致操作繁瑣、費時費力誤差較大是結構復雜和多組分抗生素效價測定的首先方法優(yōu)點㈢含量或效價測定1、微生物檢定法缺點

2、物理化學法

HPLCLC-MSUV

容量法準確可靠、專屬性高、操作簡單、省時、樣品用量少1、對結構已知或提純的抗生素2、需要標準品對照儀器分析方法㈢含量或效價測定第二節(jié)β-內酰胺類抗生素β-內酰胺類抗生素6-氨基青霉烷酸（6-APA）；青霉素類；7-氨基頭孢菌烷酸（7-ACA）；頭孢菌素類；一、結構及分類氫化噻嗪環(huán)氫化噻唑環(huán)阿莫西林

（羥氨芐青霉素）頭孢羥氨芐㈡理化性質1、酸性與溶解性2、旋光性3、紫外吸收特性4、不穩(wěn)定性酸性一、結構特點與性質Na與堿金屬(Na+、K+)成鹽

（一）羧基

易溶于水

與有機堿(普魯卡因)成鹽

難溶于水普魯卡因青霉素（二）手性C

頭孢菌素類

C6C7青霉素類C3C5C6

旋光性﹡﹡﹡﹡﹡

（三）共軛體系

頭孢菌素類母核有共軛體系

青霉素類母核無明顯UV

多數(shù)有苯環(huán)取代基

UV（四）β–內酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性

水溶液

不穩(wěn)定

干燥純凈

穩(wěn)定

不穩(wěn)定性因素四元環(huán)張力大

酰胺鍵易水解

含水量純度

青霉素類

某些氧化劑酸、堿、青霉素酶（某些金屬離子）（溫度）降解失效（四）β–內酰胺環(huán)

與含水量和純度密切相關青霉素的降解途徑青霉素的降解產物青霉噻唑酸－青霉素酶青霉酸－強酸性環(huán)境青霉烯酸－弱酸性環(huán)境青霉醛－強酸性-加熱青霉胺－強酸性-加熱/青霉素酶-重金屬降解產物二、鑒別反應（一）顯色反應1、異羥肟酸鐵反應H2NOHHClC2H5OH（紅、棕、褐）2.茚三酮反應

α-氨基-氨基茚三酮藍紫色烯醇式茚三酮酮式茚三酮縮合藍紫色+H2OCNCH2RC=ORCHH2NCOOHOC=COCOCOHNH2CCOCOCOCOHCNCCOCOCOCOHCHRNCCOCOCO3.雙縮脲反應似肽鍵（開環(huán)分解）-內酰胺類堿性酒石酸銅紫紅色紫紅色4.與重氮苯磺酸反應橙黃色重氮苯磺酸--56OHHC（偶合）酚羥基頭孢哌酮1.K+、Na+的火焰反應（二）各種鹽的反應

焰色→鮮黃色

+醋酸氧鈾鋅→↓黃

Na+

焰色→紫色

+0.1%四苯硼鈉→↓白

K+色譜法（三）1、TLC法對照品對照法2、HPLC法光譜法（四）1、UV法樣品、分解產物Cu2+頭孢氨芐λmax=262nm青霉素V鈉

A280nm/A264nm=1.30～1.502、IR法3180cm-1N-Hβ–內酰胺C=O1780cm-13470cm-1O-H1690cm-1仲酰胺C=O1250cm-1C-O以阿莫西林為例三、雜質檢查

藥物

檢查項目

檢查方法

頭孢他啶聚合物HPLC法

頭孢曲松鈉

頭孢哌酮鈉

頭孢噻肟鈉

頭孢呋辛酯有關物質和異構體HPLC法

頭孢氨芐有關物質反相TLC法

青霉素鉀（鈉）吸收度紫外分光光度法

1.頭孢他啶聚合物的測定分子排阻色譜法

固定相：葡聚糖凝膠G-10

流動相A：3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液

流動相B：0.01%十二烷基硫酸鈉

對照品溶液：頭孢他啶對照品100μg/ml

1）系統(tǒng)適用性試驗：理論塔板數(shù)和拖尾因子用1mg/ml藍色葡聚糖2000、流動相A測定；重復性用對照品溶液、流動相B測定。

N不低于900，拖尾因子0.75~1.5，峰面積的RSD應小于5.0%

2）測定方法

進樣供試液，用流動相A；進樣對照液，用流動相B。以外標法計算，含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計不得超過0.3%。2.頭孢呋辛酯中有關物質和異構體的檢查

異構體異構體A異構體B△3-異構體E異構體控制比例有關物質

3）異構體：

相對保留時間1--被測物

2--標準物異構體相對保留時間判斷B異構體0.85供試液譜圖中A異構體的峰面積A異構體1.0與A、B異構體峰面積和之比應為0.48~0.55。

異構體A異構體B頭孢呋辛酸△3-異構體E異構體E異構體有關物質高低濃度自身對照法（1%）有關物質相對保留時間判斷△3-異構體1.2不得大于對照液主峰面積之和的1.5倍（1.5%）E異構體1.7和2.1不得大于對照液主峰面積之和（1.0%）其他雜質不得大于對照液主峰面積之和的1/2（0.5%）所有雜質不得大于對照液主峰面積之和的3倍（3.0%）3.青霉素鈉（鉀）的吸收度檢查：供試液1.80mg/ml，

結果判斷：A280不得大于0.10，在264nm處有最大吸收，吸光度應為0.80-0.88.（一）高效液相色譜法原理：利用青霉素類抗生素在一定條件下在反相硅膠上的保留行為的不同而實現(xiàn)高效分離，并與標準品相對照，而對其進行定量的一種方法。優(yōu)化色譜分析條件（1）Column-CNODSC18C8-Ben（2）mobilephase/flowrate（3）columntemperature（4）detectionwavelength（5）workstationsamplepreparation四、含量測定-容量法和儀器分析法實驗注意事項（1）色譜峰要達到較好的分離－基線分離(baseseparation)（2）需要標準品對照，用外標法定量（3）可同時測定多個組分的含量（4）需要排除制劑中輔料等雜質對測定的干擾（二）生物樣本中β-內酰胺類抗生素的分析血漿尿樣唾液膽汁生物樣本色譜柱：HypersilODSC18(200mm×4.6mm,I.D.5μm)樣品制備：取血漿200μL，加入內標5μL，再加入HCLO4，窩旋提取InternalstandardIS第三節(jié)氨基糖苷類抗生素鏈霉素雙氫鏈霉素新霉素卡那霉素慶大霉素巴龍霉素鏈霉素：鏈霉胍鏈霉糖N-甲基-L-葡萄糖胺****

糖苷元絳紅糖胺+脫氧鏈霉胺+加洛糖胺

糖一、結構與性質多與硫酸成鹽鏈霉素

3個慶大霉素5個堿性中心堿性（一）水溶性溶解性（二）鏈霉素

pH5～7.5慶大霉素

pH2～12

穩(wěn)定穩(wěn)定性（四）UV（三）鏈霉素的鏈霉胍在230nm有UV吸收慶大霉素、奈替米星等無UV吸收坂口反應N-甲基葡萄糖胺反應麥芽酚反應二、

鑒別

茚三酮反應（一）△羥基胺類和α-氨基酸性質+△藍紫色（二）Molisch試驗具有五碳糖或六碳糖結構H+糠醛羥甲基糠醛α-萘酚紅紫色蒽酮藍紫色糠醛與α-萘酚呈色原理紅紫色羥甲基糠醛糠醛與蒽酮的呈色原理羥甲基糠醛藍紫色（三）N-甲基葡萄糖胺反應乙酰丙酮OH-吡咯衍生物（I）對二甲氨基苯甲醛H+櫻桃紅色（II)（Elson-Morgan反應）新霉素巴龍霉素(縮合)櫻桃紅色對二甲氨基苯甲醛H+

（4）麥芽酚反應－鏈霉素的特征反應

H+分子重排麥芽酚鏈霉素特有反應（或α-萘酚）8-羥基喹啉（五）坂口反應α-萘酚＋8－羥基喹啉鏈霉胍（六）硫酸鹽反應H+鹽酸or硝酸不溶（七）色譜法：1.TLC多以硅膠為薄層板，三氯甲烷-甲醇-濃氨水為展開劑，茚三酮或碘蒸汽為顯色劑。2.HPLC供試品溶液和對照品溶液的色譜圖進行鑒別（八）UV法鏈霉素在230nm處有紫外吸收。慶大霉素、奈替米星等無紫外吸收。（九）IR法特殊雜質的檢查及組分分析（一）鏈霉素中鏈霉素B1.來源——發(fā)酵過程中產生的甘露糖鏈霉素2.活性——鏈霉素的20%-25%3.檢查方法——TLC/水解，甘露糖為對照3.色譜條件——薄層板：硅膠G

顯色劑：1,3萘二酚-硫酸++410.pH吲哚衍生物巰基醋酸鄰苯二醛氨基λmax=330nm衍生化原理

1.(二）慶大霉素中組分C的檢查－衍生化后HPLC色譜柱、流動相、檢測波長、衍生化條件的摸索。

組分C的毒副作用和耐藥性與慶大霉素有差異，導致產品的效價和臨床療效1-烷基硫代-2-烷基異吲哚衍生物RP－HPLC方法

2.規(guī)定C125~50%C1a15~40%C2a+C220~50%計算

3.峰面積歸一化法四、

含量測定微生物檢定法

比濁法、管碟法HPLC法無ＵＶ吸收－不能直接用ＵＶ、熒光檢測器

柱前、后衍生化－ＵＶ檢測器電化學檢測器蒸發(fā)光散射檢測器第四部分：四環(huán)素類抗生素Trtracyclines

TC

理化特性（1）酸堿兩性－C4（二甲氨基）、C10（酚羥基）（2）旋光性－含有手性中心（一般為左旋）（3）紫外吸收特性－具有共軛雙鍵體系（吸收波長為長波方向）（4）與金屬離子的配位化合物反應－酚羥基和烯醇基（5）不穩(wěn)定性－對各種外界條件，包括氧化劑、酸、堿，易形成差向、脫水和異四環(huán)素，顏色加深弱酸性環(huán)境ETC差向四環(huán)素強酸性環(huán)境ATC脫水四環(huán)素堿性環(huán)境EATC異四環(huán)素差向脫水四環(huán)素二、

鑒別試驗

濃H2SO4反應（一）黃色朱紅色→黃色蘭色→黃色紫紅色→黃色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素42SOH鹽酸美他環(huán)素橙紅色FeCl3反應（二）褐色橙褐色深褐色紅棕色鹽酸多西環(huán)素鹽酸土霉素鹽酸金霉素鹽酸四環(huán)素3FeClTLC法（三）鹽酸土霉素的鑒別

HPLC法（五）EDTA

克服痕量金屬造成的拖尾現(xiàn)象比較保留時間三、

特殊雜質檢查

·

4-差向四環(huán)素（ETC）

·脫水四環(huán)素（ATC）

·差向脫水四環(huán)素（EATC）

·鹽酸金霉素（CTC）

有關物質（一）HPLC法（2000版）鹽酸四環(huán)素四環(huán)素有關物質TLC圖I.供試液(5mg/ml)ETC(0.2mg/ml)

ATC(0.025mg/ml)IV.EATC(0.025mg/ml)CTC(0.1mg/ml)VI.混合液4％0.5％0.5％2％吸收度（二）nmmax355268l、鹽酸四環(huán)素雜質吸收度

取供試品配成每10mg/ml的溶液至4cm的吸收池中，在530nm處測定，其吸收度不得超過0.12。應嚴格控制溫度和時間四、

含量測定HPLC法

鹽酸四環(huán)素的測定

系統(tǒng)適用性試驗：鹽酸四環(huán)素、有關