第三章 酶的生物合成法生產(chǎn)

第三章酶的生物合成與發(fā)酵生產(chǎn)

1酶的生產(chǎn)方法提取分離法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學(xué)合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample核糖核酸酶2本章內(nèi)容第一節(jié)酶生物合成及調(diào)節(jié)第二節(jié)酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)第三節(jié)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶第四節(jié)動(dòng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶3Reversetranscription

第一節(jié)酶生物合成及調(diào)節(jié)一、酶的生物合成

遺傳信息傳遞的中心法則4Replication復(fù)制：親代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。Transcription轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板，按照堿基配對(duì)原則將其所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補(bǔ)的RNA的過程。Translation翻譯：以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質(zhì)的AA順序的過程。Reversetranslation逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，生成DNA的過程。5（一）RNA的生物合成--轉(zhuǎn)錄(transcription).1.細(xì)胞內(nèi)RNA的生物功能(1)在某些RNA病毒中，其所含的雙鏈RNA作為遺傳信息的載體。(2)在蛋白質(zhì)的生物合成過程中，tRNA作為氨基酸載體，并由其上的反密碼子識(shí)別mRNA分子上的密碼子；mRNA作為蛋白質(zhì)合成的模板，由其分子上的三聯(lián)體密碼控制蛋白質(zhì)分子中氨基酸的排列順序；rRNA與蛋白質(zhì)一起組成核糖核蛋白體（核糖體），作為蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。6(3)某些RNA具有生物催化活性，屬于核酸類酶，在一定條件下，可以催化有關(guān)的生化反應(yīng)。(4)各種小分子RNA在分子修飾和代謝調(diào)節(jié)等方面有重要作用。2.轉(zhuǎn)錄：

以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉(zhuǎn)錄酶）的作用下，生成RNA分子的過程。7轉(zhuǎn)錄模板啟動(dòng)子（promotor)

終止子(terminator)模板鏈（templatestrand）反意義鏈(antisensestrand)編碼鏈(codingstrand)有意義鏈(sensestrand)DNA5′5′3′3′反意義鏈:指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄作用的一條DNA鏈有意義鏈:無轉(zhuǎn)錄功能的一條DNA鏈.8轉(zhuǎn)錄過程的特點(diǎn)（1）轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性。反義鏈antisensestrand（無意義鏈，負(fù)鏈）：在RNA的轉(zhuǎn)錄中，用作模板的DNA鏈稱為反義鏈。有義鏈codingstrand（編碼鏈，正鏈）：在RNA的轉(zhuǎn)錄中，不作為模板的DNA鏈稱為有義鏈。9（2）轉(zhuǎn)錄所需酶：依賴DNA的RNA聚合酶又稱為轉(zhuǎn)錄酶，是以DNA為模板的一類RNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，轉(zhuǎn)錄酶有所不同。原核生物的轉(zhuǎn)錄酶比較簡(jiǎn)單，由1種RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。而在真核生物中RNA聚合酶有3種，分別為RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ，它們都屬于寡聚酶，酶的亞基數(shù)目為4～10個(gè)，亞基種類有4～6種。10TCGAGTACAGCTCATGCGAGUACGCAURNA聚合酶有意義鏈反意義鏈RNAPPi5’5’3’GTPUTPCTPATPUTPRNA在DNA模板上的生物合成3’3’5’11

原核生物的RNA聚合酶(DDRP)

E.coli的RNA聚合酶是由四種亞基組成的五聚體（2）

起始因子12RNA合成過程起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)延長(zhǎng)階段53RNA

啟動(dòng)子（promotor)

終止子(terminator)5RNA聚合酶5353553離開13RNA鏈的延伸圖解3′5′RNA-DNA雜交螺旋聚合酶的移動(dòng)方向新生RNA復(fù)鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長(zhǎng)部位14翻譯:以RNA中mRNA為模板,按照其核苷酸順序所組成的密碼指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成的過程.mRNA蛋白質(zhì)翻譯各種信息各種蛋白質(zhì)（核苷酸排列順序）（氨基酸排列順序）（二）蛋白質(zhì)的生物合成--翻譯(translation)

15蛋白質(zhì)的合成過程

（大腸桿菌）氨基酸的活化肽鏈合成的起始肽鏈的延伸肽鏈合成的終止與釋放

蛋白質(zhì)前體的加工16氨基酸的活化與轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)式：AA+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶氨酰-tRNA+AMP+PPi對(duì)于E.coli而言，肽鏈合成時(shí)的第一個(gè)氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMet）。17在核糖體上合成多肽（三階段）1、起始階段2、延伸階段3、終止階段18原核生物肽鏈合成的起始階段是在GTP和起始因子（InitiationFactor）的參與下，核糖體30S亞基，fMet-tRNAF，mRNA和50S亞基結(jié)合，組成起始復(fù)合物的過程。主要包括5個(gè)步驟：（1）30S亞基與起始因子IF3結(jié)合；（2）30S亞基與mRNA結(jié)合，形成30S-IF3-mRNA復(fù)合物；（3）fMet-tRNAF與起始因子IF2以及GTP結(jié)合，生成fMet-tRNAF-IF2-GTP；肽鏈合成的起始階段19（4）在起始因子IF1的參與下，fMet-tRNAF-IF2-GTP與30S-IF3-mRNA結(jié)合生成30S起始復(fù)合物。在此30S起始復(fù)合物中，fMet-tRNAF上的反密碼子正好與mRNA上的起始密碼子AUG結(jié)合；（5）50S亞基與上述30S起始復(fù)合物結(jié)合，形成完整的70S核糖體。同時(shí)放出IF1，IF2，IF3，并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70S核糖體形成時(shí)，fMet-tRNAF位于70S核糖體的“P”位（肽?；唬?，而它的“A”位（氨?；唬┦强瘴?。20AUGACA5’3’AUGACA5’3’UACUACAUGACA5’3’小亞基mRNA蛋氨酰tRNA+GTP+IF2大亞基GDP+Pi受位給位蛋蛋肽鏈合成的起始階段IF3IF3IF121肽鏈合成的延伸階段1.進(jìn)位:氨基酰-tRNA進(jìn)入受位;2.轉(zhuǎn)肽:形成肽鍵,在轉(zhuǎn)肽酶作用下,給位與受位結(jié)合;3.移位:核蛋白體向3’端移動(dòng)一個(gè)密碼子的位置,空出受位,不斷地進(jìn)位、轉(zhuǎn)肽、移位,使肽鏈延長(zhǎng)。22AUGACA5’3’UAC蛋蘇UGUAUGACA5’UAC蛋蘇UGUGUUAUGACA5’UAC蛋蘇UGUGUUAUGACA5’蛋蘇UGUGUU3’3’3’GTPGDP+PiGDP+PiGTP起始復(fù)合體進(jìn)位轉(zhuǎn)肽移位Mg+K+23肽鏈合成的終止階段1.出現(xiàn)終止密碼并與終止因子結(jié)合;2.肽鍵水解,多肽釋放;3.tRNA,mRNA,大小亞基解離.

24AUGUAA5’UACAUGUAA5’UAC3’3’終終AUGUAA5’UAC3’終5’3’UAC終肽鏈2526蛋白質(zhì)前體的加工N端fMet或Met的切除二硫鍵的形成特定氨基酸的修飾切除新生肽鏈中的非功能片段肽鏈的折疊亞基的聚合27二、酶生物合成的調(diào)節(jié)定義：通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制，是在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的。意義：通過阻止酶的過量合成，節(jié)約生物合成的原料和能量。28操縱子——基因表達(dá)的協(xié)同單位操縱子結(jié)構(gòu)基因（編碼蛋白質(zhì),structuralgene,S）控制部位操縱基因（operatorgene,O）啟動(dòng)子（promotorgene,P）（一）基因調(diào)控理論

JacobandMonod的操縱子學(xué)說（operontheory）

29基因操縱子調(diào)節(jié)系統(tǒng)示意圖

調(diào)節(jié)基因

啟動(dòng)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因

DNA

轉(zhuǎn)錄

（-）

RNA聚合酶（+）轉(zhuǎn)錄

翻譯

mRNA

翻譯

阻遏蛋白

蛋白質(zhì)

誘導(dǎo)劑

控制區(qū)信息區(qū)操縱子30

調(diào)節(jié)基因(regulatorgene)：

可產(chǎn)生一種組成型調(diào)節(jié)蛋白(regulatoryprotein)（一種變構(gòu)蛋白），通過與效應(yīng)物(effector)（包括誘導(dǎo)物和輔阻遏物）的特異結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)作用，從而改變它與操縱基因的結(jié)合力。調(diào)節(jié)基因常位于調(diào)控區(qū)的上游。31cAMP-CRP復(fù)合物的作用示意圖

啟動(dòng)基因（promotorgene）（啟動(dòng)子）：有兩個(gè)位點(diǎn)：

（1）RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)（2）cAMP-CAP的結(jié)合位點(diǎn)。CAP：分解代謝產(chǎn)物基因活化蛋白（catabolitegeneactivatorprotein），又稱環(huán)腺苷酸受體蛋白(cAMPreceptorprotein，CRP）。只有cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，RNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動(dòng)子的位點(diǎn)上，酶的合成才能開始。

32操縱基因（Operatergene）:

位于啟動(dòng)基因和結(jié)構(gòu)基因之間的一段堿基順序，能特異性地與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的變構(gòu)蛋白結(jié)合，操縱酶合成的時(shí)機(jī)與速度。結(jié)構(gòu)基因（Structuralgene）:

決定某一多肽的DNA模板，與酶有各自的對(duì)應(yīng)關(guān)系，其中的遺傳信息可轉(zhuǎn)錄為mRNA，再翻譯為蛋白質(zhì)。33(二)酶合成調(diào)節(jié)的類型

1.誘導(dǎo)

(induction)

組成酶：細(xì)胞固有的酶類。誘導(dǎo)酶：是細(xì)胞為適應(yīng)外來底物或其結(jié)構(gòu)類似物而臨時(shí)合成的一類酶。

2.阻遏(repression)分解代謝物阻遏(cataboliterepression)反饋?zhàn)瓒?feedbackrepression)34（三）酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制

1.酶合成的誘導(dǎo)

加進(jìn)某種物質(zhì)，使酶生物合成開始或加速進(jìn)行。酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象：

已知分解利用乳糖的酶有：

-半乳糖苷酶；-半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。35實(shí)驗(yàn)：（1）大腸桿菌生長(zhǎng)在葡萄糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)無上述三種酶合成；（2）大腸桿菌生長(zhǎng)在乳糖培養(yǎng)基上時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成；（3）表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則：需要時(shí)才合成。36調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因PLacZLacYLacamRNA阻遏蛋白（有活性）基因關(guān)閉啟動(dòng)子ORPLacZLacYLaca調(diào)節(jié)基因操縱基因乳糖結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子ORmRNAZmRNAYmRNAa阻遏蛋白（無活性）基因表達(dá)mRNAA、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)

B、乳糖酶的誘導(dǎo)

乳糖阻遏蛋白（有活性）誘導(dǎo)作用372.產(chǎn)物阻遏（反饋?zhàn)瓒簦?/p>

由某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量累積引起的阻遏。

酶合成阻遏的現(xiàn)象：

實(shí)驗(yàn)：

（1）大腸桿菌生長(zhǎng)在無機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí)，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；

（2）在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌體生長(zhǎng)的經(jīng)濟(jì)原則:不需要就不合成。38色氨酸操縱子——酶的阻遏調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)39酶的誘導(dǎo)和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導(dǎo)劑A.有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因啟動(dòng)基因調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因阻遏蛋白(有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因可以表達(dá)阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結(jié)構(gòu)基因不表達(dá)代謝產(chǎn)物40調(diào)控方式阻遏蛋白添加物與操縱基因結(jié)合阻遏效應(yīng)舉例酶的誘導(dǎo)有活性－＋不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯誘導(dǎo)物－轉(zhuǎn)錄，繼而翻譯乳糖操縱子酶的阻遏無活性－阻遏物＋不轉(zhuǎn)錄，繼而不翻譯色氨酸操縱子酶合成的誘導(dǎo)與阻遏操縱子模型調(diào)控作用對(duì)比413.分解代謝物阻遏指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時(shí)，利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結(jié)果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產(chǎn)生的中間代謝物所引起的阻遏作用。42分解代謝物阻遏現(xiàn)象：實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，優(yōu)先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產(chǎn)生了兩個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中間隔開一個(gè)生長(zhǎng)延滯期的“二次生長(zhǎng)現(xiàn)象”(diauxie或biphasicgrowth）。這一現(xiàn)象又稱葡萄糖效應(yīng)，產(chǎn)生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物是環(huán)腺苷酸受體蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活化蛋白(CAP)。43分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表達(dá)CAP基因結(jié)構(gòu)基因TCAPOCAP結(jié)合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代謝產(chǎn)物腺苷酸環(huán)化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物與cAMP的關(guān)系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolicgeneactivationprotein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態(tài)44

第二節(jié)酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

一、細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

在分批培養(yǎng)(batchculture)過程中，細(xì)胞生長(zhǎng)一般要經(jīng)歷延遲期、指數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、靜止期和衰亡期5個(gè)階段。45

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線O-A延遲期A-B指數(shù)生長(zhǎng)期B-C減速期C-D靜止期D-E衰亡期

46

營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度）和生長(zhǎng)速率之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系：Monod模型μ:比生長(zhǎng)速率（1/h）（specificgrowthrate）μmax：最大比生長(zhǎng)速率（1/h）S：營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度）克/LKs：莫諾德常數(shù)或飽和常數(shù)或營(yíng)養(yǎng)物利用常數(shù)克/L，或mol/L471前提：假設(shè)培養(yǎng)基中只有一種限制性基質(zhì)，而不存在其他生長(zhǎng)限制因素時(shí)，比生長(zhǎng)速率為這種限制性基質(zhì)濃度的函數(shù)。2當(dāng)S>>Ks時(shí)，μ=μmax。3Ks為莫諾德常數(shù)，是指比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大生長(zhǎng)速率一般時(shí)的限制性基質(zhì)濃度。即，當(dāng)μ=0.5μmax時(shí)，S=Ks。Monod模型4849

二、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)

（一）酶生物合成的模式

根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系，可將酶的生物合成分為3種模式，即：

同步合成型生長(zhǎng)偶聯(lián)型——中期合成型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型——延續(xù)合成型非生長(zhǎng)偶聯(lián)型——滯后合成型501.生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱同步合成型）酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步。特點(diǎn)：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。當(dāng)去除誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成立即停止，表明這類酶所對(duì)應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定。51生長(zhǎng)偶聯(lián)型中的特殊形式——中期合成型

酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后才開始，而在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點(diǎn)：酶的合成受產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒艋蚍纸獯x物阻遏。所對(duì)應(yīng)的mRNA是不穩(wěn)定的。

枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線

522.部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱延續(xù)合成型）

酶的合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長(zhǎng)一段時(shí)間。特點(diǎn)：可受誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。所對(duì)應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線533.非生長(zhǎng)偶聯(lián)型（又稱滯后合成型）

只有當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點(diǎn)：受分解代謝物的阻遏作用。所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線

54總結(jié)：影響酶生物合成模式的主要因素1）mRNA的穩(wěn)定性高：可在細(xì)胞停止生長(zhǎng)后繼續(xù)合成酶差：隨著細(xì)胞停止生長(zhǎng)而終止酶的合成2）培養(yǎng)基中阻遏物的存在不受阻遏：隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而開始酶的合成。受阻遏：細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或平衡期后，酶才開始合成。55

酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞開始生長(zhǎng)就有酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時(shí)間。

對(duì)于：同步合成型：提高對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面努力。56(二)產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)一般產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程可表達(dá)為：式中X——細(xì)胞濃度(g/L)

——細(xì)胞比生長(zhǎng)速率(h-1) ——生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)(IU/g) ——非生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率(IU/(gh))E——酶濃度(IU/L)t——時(shí)間(h)57生長(zhǎng)偶聯(lián)型部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型

非生長(zhǎng)偶聯(lián)型

58第三節(jié)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶一、產(chǎn)酶微生物的分離和選育1.優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應(yīng)具備的條件（1）酶產(chǎn)量高（2）易培養(yǎng)（生長(zhǎng)速率高、營(yíng)養(yǎng)要求低）（3）遺傳性能穩(wěn)定，不易退化（4）易分離提純（5）安全可靠（不是致病菌）592.常用的產(chǎn)酶微生物EscherichiacoliPseudomonas(假單胞菌)

Bacillussubtilis（枯草桿菌）MicrococcusStreptococcus(鏈鎖狀球菌

)Streptomyces(鏈霉菌

)Aspergillusniger（黑曲霉）Aspergillusoryzae(米曲霉

)Monascus(紅曲霉)Penicillium(青霉

)Trichoderma(木霉

)Rhizopus(根霉

)Mucor(毛霉

)Absidia(犁頭霉

)

Saccharomycescerevisiae

Candida(假絲酵母

)60(1)大腸埃希氏桿菌，簡(jiǎn)稱為大腸桿菌，是最為著名的原核生物。形態(tài)：短桿或長(zhǎng)桿狀，0.5～1.0×1.0～3.0um，革蘭氏陰性，運(yùn)動(dòng)(周毛)或不運(yùn)動(dòng)，無芽孢，一般無莢膜。菌落呈白色至黃白色，擴(kuò)展，光滑，閃光。大多數(shù)大腸桿菌是無害，但也有些大腸桿菌是致病的，會(huì)引起腹瀉和尿路感染。大腸桿菌的名聲主要因它易于在實(shí)驗(yàn)室操作、生長(zhǎng)迅速，而且營(yíng)養(yǎng)要求低。61應(yīng)用： 大腸桿菌能作為宿主供大量的細(xì)菌病毒生長(zhǎng)繁殖 大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌

工業(yè)上生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等62(2)醋酸桿菌（Acetobacter）

菌體從橢圓至桿狀，單個(gè)、成對(duì)或成鏈，革蘭氏陰性，運(yùn)動(dòng)（周毛）或不運(yùn)動(dòng)，不生芽孢。好氣。含糖、乙醇和酵母膏的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。應(yīng)用：有機(jī)酸(食醋等）葡萄糖異構(gòu)酶(高果糖漿)山梨糖(維C中間體）63(3)枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）

直狀、近直狀的桿菌，周生或側(cè)生鞭毛，革蘭氏陽性，無莢膜，芽孢0.5×1.51.8m，中生或近中生。枯草芽孢桿菌是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。64(4)根霉(Rhizopus)分類學(xué)上屬于藻狀菌綱，毛霉目，根霉屬。根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培養(yǎng)基上固著，并吸收營(yíng)養(yǎng)）。分布于土壤、空氣中，常見于淀粉食品上，可引起霉腐變質(zhì)和水果、蔬菜的腐爛。代表種：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。65應(yīng)用：根霉能產(chǎn)生一些酶類，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，是生產(chǎn)這些酶類的菌種。在釀酒工業(yè)上常用做糖化菌。有些根霉還能產(chǎn)生乳酸、延胡索酸等有機(jī)酸66(5)曲霉(Aspergillus)

分類：多數(shù)屬于子囊菌亞門，少數(shù)屬于半知菌亞門。分布：廣泛分布于土壤、空氣和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質(zhì)，有的可產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素。代表種：黑曲霉Asp.Niger黃曲霉Asp.flavus67應(yīng)用：是制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產(chǎn)酶制劑（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶）的菌種。生產(chǎn)有機(jī)酸（如檸檬酸、葡萄糖酸等）。農(nóng)業(yè)上用作生產(chǎn)糖化飼料的菌種。683.產(chǎn)酶微生物的分離和篩選

1)樣品的采集:從富含該酶作用底物的場(chǎng)所采集樣品2)富集培養(yǎng):投其所好，取其所抗3)分離獲得微生物的純培養(yǎng)（pureculture）。4)初篩：選出產(chǎn)酶菌種，以多為主。5)復(fù)篩：選出產(chǎn)酶水平相對(duì)較高的菌株，以質(zhì)為主。

69

-淀粉酶的篩選70蛋白酶產(chǎn)生菌的獲得方法應(yīng)用含酪蛋白的培養(yǎng)基714.產(chǎn)酶微生物優(yōu)良菌種的選育

誘變育種原生質(zhì)體融合育種基因工程育種72

二.微生物發(fā)酵產(chǎn)酶方法

1.固體培養(yǎng):特別適合于霉菌培養(yǎng)2.液體培養(yǎng):目前酶發(fā)酵生產(chǎn)的主要方式3.固定化細(xì)胞:需要特殊的固定化細(xì)胞反應(yīng)器

73三.微生物酶的類型

1.胞外酶：大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶），是微生物為了利用環(huán)境中的大分子而釋放到細(xì)胞外的，即使胞外濃度很高，胞內(nèi)也能維持較低水平，受到的調(diào)節(jié)控制少。2.胞內(nèi)酶：指合成后仍留在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的酶，酶活性和濃度受到中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的調(diào)控。74四、酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程

75五、酶的發(fā)酵工藝條件與控制1、培養(yǎng)基2、發(fā)酵條件及控制3、提高產(chǎn)酶的措施761、培養(yǎng)基各種生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求771、選擇適宜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)2、營(yíng)養(yǎng)物的濃度及配比合適3、物理、化學(xué)條件適宜4、經(jīng)濟(jì)節(jié)約5、精心設(shè)計(jì)、試驗(yàn)比較培養(yǎng)不同的微生物必須采用不同的培養(yǎng)條件；培養(yǎng)目的不同，原料的選擇和配比不同；不同階段，培養(yǎng)條件也有所差異。培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)原則任何培養(yǎng)基都應(yīng)該具備微生物生長(zhǎng)所需要五大營(yíng)養(yǎng)要素：碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、水。78實(shí)驗(yàn)室的常用培養(yǎng)基：細(xì)菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（或簡(jiǎn)稱普通肉湯培養(yǎng)基）；放線菌：高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基；霉菌：查氏合成培養(yǎng)基；例如枯草芽孢桿菌：一般培養(yǎng)：肉湯培養(yǎng)基或LB培養(yǎng)基；自然轉(zhuǎn)化：基礎(chǔ)培養(yǎng)基；觀察芽孢：生孢子培養(yǎng)基；產(chǎn)蛋白酶：以玉米粉、黃豆餅粉為主的產(chǎn)酶培養(yǎng)基。792、發(fā)酵條件及控制培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類型微生物的生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。為了維持培養(yǎng)基pH的相對(duì)恒定，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑，或在進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵時(shí)補(bǔ)加酸、堿。通常培養(yǎng)條件：細(xì)菌與放線菌：pH7~7.5酵母菌和霉菌：pH4.5~6范圍內(nèi)生長(zhǎng)（1）pH值的控制80細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH值與生長(zhǎng)最適pH值往往有所不同。細(xì)胞生產(chǎn)某種酶的最適pH值通常接近于該酶催化反應(yīng)的最適pH值。

有些細(xì)胞可以同時(shí)產(chǎn)生若干種酶，在生產(chǎn)過程中，通過控制培養(yǎng)基的pH值，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。81枯草桿菌堿性磷酸酶酶作用最適PH9.5,產(chǎn)酶最適PH7.4黑曲霉PH偏中性，淀粉酶產(chǎn)量增加，糖化酶減少PH偏酸性，淀粉酶產(chǎn)量減少，糖化酶增加米曲霉PH偏堿性，生產(chǎn)堿性蛋白酶PH偏中性或酸性，生產(chǎn)中性或酸性蛋白酶82通常在生物學(xué)范圍內(nèi)每升高10℃，生長(zhǎng)速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應(yīng)，對(duì)于微生物來說，溫度直接影響其生長(zhǎng)和合成酶。（2）溫度的控制有些細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與細(xì)胞生長(zhǎng)最適溫度有所不同，而且往往低于生長(zhǎng)最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，增加酶生物合成的延續(xù)時(shí)間，從而提高酶的產(chǎn)量。枯草桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為34～37℃黑曲霉的最適生長(zhǎng)溫度為28～32℃83醬油曲霉生產(chǎn)蛋白酶，28℃下發(fā)酵，其蛋白酶的產(chǎn)量比在40℃下提高2-4倍，在20℃下更高。但并不是溫度越低越好，若溫度過低，生化反應(yīng)速度很慢，反而降低了酶產(chǎn)量，延長(zhǎng)發(fā)酵周期。因此必須進(jìn)行試驗(yàn)，以確定最佳的產(chǎn)酶溫度。84發(fā)酵初期——合成——吸熱——保溫旺盛期——分解——放熱——降溫排管、蛇管、夾套、噴淋裝置85（3）溶解氧的控制在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，處于不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞，其細(xì)胞濃度和細(xì)胞呼吸強(qiáng)度各不相同，致使耗氧速率有很大的差別。因此必須根據(jù)耗氧量的不同，不斷供給適量的溶解氧。培養(yǎng)液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速度。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時(shí)間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質(zhì)等有密切關(guān)系。86調(diào)節(jié)通氣量調(diào)節(jié)氧的分壓調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間調(diào)節(jié)氣液接觸面積改變培養(yǎng)液的性質(zhì)控制溶解氧方法一般說來，通氣量越大、氧氣分壓越高、氣液接觸時(shí)間越長(zhǎng)、氣液接觸面積越大，則溶氧速率越大。培養(yǎng)液的性質(zhì)，主要是黏度、氣泡、以及溫度等對(duì)于溶氧速率有明顯影響。增加液層高度，增加擋板空氣分配管、攪拌873、提高酶產(chǎn)量的措施（1）添加誘導(dǎo)物對(duì)于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵過程中的某個(gè)適宜的時(shí)機(jī)，添加適宜的誘導(dǎo)物，可以顯著提高酶的產(chǎn)量。例如，乳糖誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導(dǎo)蔗糖酶的生物合成等。誘導(dǎo)物一般可以分為3類

酶的作用底物酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物作用底物的類似物88（2）控制阻遏物的濃度阻遏作用根據(jù)機(jī)理不同，可分為：產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。1.產(chǎn)物阻遏作用是由酶催化作用的產(chǎn)物或者代謝途徑的末端產(chǎn)物引起的阻遏作用。2.分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過分解代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)）引起的阻遏作用?？刂谱瓒粑锏臐舛仁墙獬瓒?、提高酶產(chǎn)量的有效措施。89為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應(yīng)當(dāng)控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度。采用其他較難利用的碳源，如淀粉等采用補(bǔ)料、分次流加碳源添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP）對(duì)于受代謝途徑末端產(chǎn)物阻遏的酶，可以通過控制末端產(chǎn)物的濃度的方法使阻遏解除。90（3）添加表面活性劑表面活性劑可以與細(xì)胞膜相互作用，增加細(xì)胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、特里頓(Triton)等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產(chǎn)量增加。由于離子型表面活性劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑（如‘新潔而滅’等）是消毒劑，對(duì)細(xì)胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中添加到培養(yǎng)基中。91（4）添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶、但是作用機(jī)理未闡明清楚的物質(zhì)。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1～20倍；添加聚乙烯醇（Polyvinylalcohol）可以提高糖化酶的產(chǎn)量。產(chǎn)酶促進(jìn)劑對(duì)不同細(xì)胞、不同酶的作用效果各不相同，現(xiàn)在還沒有規(guī)律可循，要通過試驗(yàn)確定所添加的產(chǎn)酶促進(jìn)劑的種類和濃度。92第四節(jié)動(dòng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶與微生物細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培養(yǎng)工藝。

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植物、動(dòng)物、微生物細(xì)胞的特性比較細(xì)胞種類植物細(xì)胞微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞大小/um200～3001～1010～100倍增時(shí)間/h﹥120.3-6﹥15營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單簡(jiǎn)單復(fù)雜光照要求大多數(shù)要求不要求不要求對(duì)剪切力敏感大多數(shù)不敏感非常敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等94三者之間的差異主要有：植物細(xì)胞>動(dòng)物細(xì)胞>微生物細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長(zhǎng)。植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)要求較簡(jiǎn)單。植物細(xì)胞的生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝物的生產(chǎn)要求一定的光照。植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感。植物、微生物和動(dòng)物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。95一、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶1.植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基特點(diǎn)

應(yīng)用最廣的是MS培養(yǎng)基和LS培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基是1962年由Murashinge和Skoog為煙草細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。LS培養(yǎng)基是在其基礎(chǔ)上演變而來的。96MS培養(yǎng)基組成:

配制1升（1000毫升）培養(yǎng)基時(shí)，加硝酸銨1.65克、硝酸鉀1.9克、氯化鈣0.44克、硫酸鎂0.37克、磷酸二氫鉀0.17克、碘化鉀0.83毫克、硼酸5.2毫克、硫酸鎂22.3毫克、硫酸鋅3.6毫克、鉬酸鈉0.25毫克、硫酸銅0.025毫克、氯化鈷0.025毫克、硫酸鐵27.8毫克、蔗糖30克和瓊脂7克。需要大量無機(jī)鹽、多種維生素和植物生長(zhǎng)激素、無機(jī)氮源、蔗糖碳源

2.培養(yǎng)方法：——懸浮細(xì)胞培養(yǎng)①細(xì)胞株的建立；外植體與愈傷組織②擴(kuò)大培養(yǎng)；③大罐培養(yǎng)；97外植體的選擇：

從植株取出，經(jīng)過預(yù)處理后，用于植物組織培養(yǎng)的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實(shí)、種子等）的片段或小塊。

從理論上講，植物細(xì)胞都具有全能性，能夠再生新植株，任何器官、任何組織、單個(gè)細(xì)胞和原生質(zhì)體都可以作為外植體。

98但實(shí)際上，不同品種、不同器官之間的分化能力有巨大差異，培養(yǎng)的難易程度不同。為保證植物組織培養(yǎng)獲得成功，選擇合適的外植體是非常重要的。外植體首先選擇無病蟲