激光掃描共聚焦顯微鏡dabian

LaserScanningConfocalMicroscopy激光掃描共聚焦顯微鏡一、簡介激光掃描共聚焦顯微鏡是上世紀(jì)八十年代發(fā)展起來的一項(xiàng)具有劃時代意義的高科技產(chǎn)品。激光掃描共聚焦顯微鏡是當(dāng)今世界上最先進(jìn)的分子細(xì)胞生物學(xué)分析儀器。它是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置,利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理,使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針,從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像,在亞細(xì)胞水平上觀察生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化,成為形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具。激光掃描共聚焦顯微鏡在材料科學(xué)、地質(zhì)科學(xué)等工業(yè)工程方面也有著廣泛應(yīng)用。激光掃描共聚焦顯微鏡利用激光掃描束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對標(biāo)本內(nèi)焦平面上的每一點(diǎn)掃描，標(biāo)本上的被照射點(diǎn)，在探測針孔處成像，有探測針孔后的光電倍增管（PMT）或冷電感耦合器件（cCCD）逐點(diǎn)或逐線接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視屏幕上形成熒光圖像。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時聚焦于照明針孔和探測針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會在探測針孔處成像，這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面。在顯微鏡的載物臺上加上一個微量步進(jìn)馬達(dá)，可使載物臺上下步進(jìn)移動，最小步進(jìn)距離現(xiàn)在已達(dá)到10nm，則細(xì)胞或組織各個橫斷面的圖像都能清楚的顯示，實(shí)現(xiàn)了光學(xué)切片的目的。FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterObjectiveLaserPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterConfocalMicroscope熒光顯微鏡的缺點(diǎn):1.無法實(shí)現(xiàn)對熒光,透射光的同時采集,無法實(shí)現(xiàn)多熒光的同時采集2.熒光散射光太強(qiáng)，造成實(shí)際分辨率的大大下降。3.熒光漂白很快，使熒光圖像的拍照有困難。4.無法對樣品進(jìn)行斷層掃描,完成3D的工作.5.對于信號較弱的樣本,無法提高觀察的靈敏度.6.可以觀查活細(xì)胞或組織但細(xì)胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊ConfocalvsNonconfocalSpatialresolutionAxialresolution高分辨率的掃描,強(qiáng)大的ZOOM功能,精細(xì)的觀察高分辨率的掃描,強(qiáng)大的ZOOM功能,精細(xì)的觀察藥物緩釋觀察時間分辨和快速掃描動態(tài)圖像出色的反射光圖像明場，DIC,相差和透射光圖像

單標(biāo)，雙標(biāo)和三標(biāo)圖像

激光共聚焦顯微成像技術(shù)的應(yīng)用二、基本結(jié)構(gòu):激光光源(根據(jù)用戶要求選裝四種波長）掃描裝置（X,Y,Z,t掃描方式自由組合）顯微鏡（物鏡放大倍數(shù)10至100）檢測器（獨(dú)立的四個檢測器，可同時測量）計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)：包括數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換及相應(yīng)應(yīng)用軟件圖像輸出設(shè)備及光學(xué)裝置（如光學(xué)濾片，分光器，共聚焦針孔及相應(yīng)的控制系統(tǒng)）結(jié)構(gòu)示意圖激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用單、雙、三,四色標(biāo)記檢測。精確的一、二、三、四維觀察。高品質(zhì)的熒光成像、透射成像、物體表面反射成像。靜態(tài)和動態(tài)觀察(Ca2+,pH,膜電位,膜流動性等)。定性以及定量分析。光譜掃描,ROI掃描.特殊的光反應(yīng)(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等)。

一.定位、定量免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三標(biāo)）的定位、定量如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布，微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位、干細(xì)胞的分化細(xì)胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI

末端原位雜交-fitc+PI熒光原位雜交：染色體基因定位單細(xì)胞凝膠電泳GFP的表達(dá)活細(xì)胞或活體組織靜息游離Ca2+

的分布與定量活細(xì)胞內(nèi)pH的定量、膜電位的測量活細(xì)胞內(nèi)自由基水平的定量Helagreen-中心體red-紡錘體

Immuno-fluorecencelabel定位、定量研究中常用熒光探針1.Amine-ReactiveProbes

與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等FITC異硫氰基熒光素(四甲基異硫氰基羅丹明)494/518TRITC544/572Cy5650/690AlexaFluor488488/530PE(藻紅蛋白)565/578TexasRed(德州紅)595/615Cy3490/530BODIPYFL503/512BODIPYTMR543/569BODIPYTR592/6181)細(xì)胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白

免役熒光標(biāo)記：與抗體耦聯(lián),直標(biāo):一抗+熒光探針間標(biāo):二抗+熒光探針如:微管蛋白(抗tublin抗體+熒光探針)肌動蛋白(Palloidine+熒光探針)2)細(xì)胞膜表面受體

配體+熒光探針如:nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)

標(biāo)記Gm1:霍亂毒素受體霍亂毒素+FITC

2.標(biāo)記細(xì)胞器熒光探針1)線粒體Mitochondria

Rodamin123505/534，可染活細(xì)胞，陽離子性,可檢測線粒體膜電位,且在多數(shù)細(xì)胞中停留時間短

JC1線粒體膜電位低時為單體490/527發(fā)綠光線粒體膜電位高時為多聚體490/590發(fā)紅光可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最佳探針MitotrackerGreenFM490/516,染活細(xì)胞或固定細(xì)胞,穩(wěn)定不漏出MitotrackerOrangeCMTMRos551/576,(氧化型)MitotrackerOrange還原型,只能染活細(xì)胞2)溶酶體Lysosome

中性紅541/640:微偏堿性,可標(biāo)記溶酶體等酸性器官

為非特異性

AO:LysoTrackerGreenDND-26504/511,染活細(xì)胞

LysoTrackerBlueLysoTrackerRed3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)EndoplasmicReticulum

DiOC6484/500:非特異性,較高濃度標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng),較低濃度標(biāo)記線粒體4)高爾基體GolgiapparatusNBDC6-ceramie466/536,可染活或死細(xì)胞

5)細(xì)胞核

PIpropidiumiodide536/617DNA/\RNA死細(xì)胞碘化丙啶EBethidiumbromide518/617DNA/RNA死細(xì)胞Hochest33342352/461DNAA-T活細(xì)胞Hochest33258(同上)DAPI358/461DNAA-T半通透細(xì)胞ChromomycinA3450/470DNAG-CAO500/526DNA活細(xì)胞460/650RNATOTO-1514/533DNA 死細(xì)胞SYTO11~1620~24488/520活細(xì)胞SYTO11~1620~24521/556活細(xì)胞SYTO17 621/634 活細(xì)胞3.GFP綠色熒光蛋白GFP的的發(fā)現(xiàn)：60年代，Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白GFP,

后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFP在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光。

將外源基因與GFPDNA相連,GFP可作為外源基因的報(bào)告基因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達(dá)GFP主要應(yīng)用:

對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動態(tài)觀察如:可實(shí)時原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中的時空表達(dá)

GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞,可動態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程

GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連,轉(zhuǎn)染后，就能顯示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體、胞內(nèi)體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)，用于定位標(biāo)志?？捎糜陔p標(biāo)記或三標(biāo)記4.量子點(diǎn)（QuantumDots）"Thedevelopmentofsemiconductornanocrystalsforbiologicallabelinggivesbiologistsanentirenewclassoffluorescentprobesforwhichnosmallorganicmoleculeequivalentexists,"theauthorsoftheSciencepaperwrote."Thesenanocrystalprobescanbecomplementaryandinsomecasesmaybesuperiortoexistingfluorophores."comparedwithconventionalfluorophores,semiconductornanocrystalshavea"narrow,tunable,symmetricemissionspectrum,andarephotochemicallystable."

Science

281,2013-2016(1998).

二.光學(xué)切片和三維重組光學(xué)切片和三維重組:LSCM通過薄層光學(xué)切片功能，可獲得標(biāo)本真正意義上的三維數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理及三維重建軟件，產(chǎn)生生動逼真的三維效果，可進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系，用以闡明三維結(jié)構(gòu)與組織功能之間的關(guān)系。

3Dreconstruction

三.動態(tài)測量Physiology:細(xì)胞內(nèi)離子動態(tài)變化測量1)游離Ca2+測量

檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10xkd,Kd和很多因素有關(guān)，如pH、Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值(10-100nM)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）

熒光探針激發(fā)波長 發(fā)射波長KdFLuo3-AM,K+,dextran506nm 525nm390nMFluo4 506nm525nm CalciumGreen-1507nm 530nm190nMCalciumGreen-2507nm 535nm550nMFurared 420/480nm 637nm140nMOregonGreen488 494n520nm 20,000nMCalciumCrimson 583nm 602nm328nMIndo-1 356nm405/458nm230nMFura-2 340/380nm476nm145nM

細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+測量的應(yīng)用鈣的特性1．細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度103-104倍2．細(xì)胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣明顯升高3．細(xì)胞內(nèi)鈣為細(xì)胞激活“開關(guān)”細(xì)胞內(nèi)鈣的生理作用1．肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián)2．神經(jīng)遞質(zhì)的釋放3．學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng)4．卵子受精5．細(xì)胞分裂和再生6．細(xì)胞調(diào)亡7．細(xì)胞間通訊8．細(xì)胞信號傳導(dǎo)9.DNA合成10.基因表達(dá)2）pH值的檢測：

BCECF-AM 490nm530nm6.5-7.5Snarf-1-AM488nm580/640nm7.0-8.03）自由基的檢測熒光探針：H2DCF-DA2-氫，2氯熒光素乙酰乙酸鹽（504nm/529nm）

胞外H2DCF-DA------擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi)-----酯酶脫乙酰----DCF-H(不發(fā)光）------DCF（發(fā)光）*樣品不能在鏡下用汞燈照射

Dihydrorhodamine123（507nm/529nm）H2rhod123----被動擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi)----在細(xì)胞內(nèi)被氧化成rod123（發(fā)光）四.細(xì)胞膜電位的測量標(biāo)記膜電位探針(慢反應(yīng)）：JC1510nm 530/590nmDioc5(3)548nm 573nmDioc6(3)484nm 500nm快反應(yīng)探針：Di-4-ANEPPS496nm 703nmDi-4-ANEPPS498nm 713nm細(xì)胞膜靜息膜電位：-70mV線粒體膜電位：-150mV以上均屬于陽離子探針，更容易與線粒體親和，為線粒體膜電位探針

質(zhì)膜流動性測定:

細(xì)胞膜熒光探針受到極性光線激發(fā)后，其發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn)，而這種有序的運(yùn)動自由度依賴于熒光分子周圍的膜流動性。膜的磷脂酸組成分析；藥物效應(yīng)和作用位點(diǎn)；溫度反應(yīng)測定及物種比較等。五.籠鎖解籠鎖的測量

NBD-Ca2+NBD-IP3NBDNBD+Ca2+IP3紫外光光活化技術(shù)

許多重要的生物活性物質(zhì)和化合物（如神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)第二信使、核苷酸、Ca2+及某些熒光素等）均可形成籠鎖化合物。當(dāng)處于籠鎖狀態(tài)時，其功能被封閉；一旦被特定波長的瞬間光照射，則因光活化而解籠鎖，其原有活性和功能得以恢復(fù)，從而在細(xì)胞增殖、分化等生物代謝過程中發(fā)揮作用。肌肉生理；鈣和膜電位對神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)作用；鈣振蕩的機(jī)制；微管和微絲的動力學(xué)。六．熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescenceResonanceEnergyTransfer)能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個部位向另一個部位的傳遞，或能量從一個分子向另一個分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件兩個熒光分子：供體-FL1，受體-FL2供體與受體的距離在2-7nm供體的發(fā)射波長與受體的激發(fā)波長一致熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)

FRET是一個無輻射、量子級能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，指的是當(dāng)一個熒光分子（供體）受到激發(fā)時，能量像鄰近的另一熒光基團(tuán)（受體）轉(zhuǎn)移的過程。兩個熒光基團(tuán)的距離可以通過FRET的效率來計(jì)算。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)

生物大分子結(jié)構(gòu)和功能研究免疫分析核酸雜交分析蛋白質(zhì)間相互作用研究r:分子間距離R0:分子間發(fā)生50%能量轉(zhuǎn)移的距離

DAr>2R0Dr<2R0A檢測

以FL1的激發(fā)波長的光照射樣品，沒有共振轉(zhuǎn)移時，只檢測到FL1的發(fā)射光(綠光)，發(fā)生共振轉(zhuǎn)移時，就可檢測出

FL1的熒光(綠光)減弱，F(xiàn)L2(紅光)的增強(qiáng)。應(yīng)用：檢測大分子的相互作用大分子構(gòu)象的改變(蛋白)例：大分子(亞基)的結(jié)合與分離受體與配體的結(jié)合

常用熒光探劑：FITC/TRITC,Cy3/Cy5,BFP/GFP

生物學(xué)意義上的共定位（Co-localization），是指兩個或多個分子完全處于同一空間位置上。這些分子一般是指蛋白，可以用熒光抗體或探針加以檢測。七.位置相關(guān)性

八材料科學(xué)研究Zaslavskaiaet.al,MartekBiosciences,MD,June15,2001November

2001;Volume128(21):pp4301-4314.Courtesy:Jose-EduardoGomes,UniversityofOregon,USANature,25April2002,pg854.

激光掃描共聚焦顯微鏡現(xiàn)在在世界許多研究機(jī)構(gòu)成為常規(guī)儀器。

細(xì)菌學(xué)生物化學(xué)細(xì)胞生物學(xué)組織胚胎學(xué)食品科學(xué)遺傳學(xué)藥理學(xué)生理學(xué)神經(jīng)科學(xué)植物學(xué)病理學(xué)材料科學(xué)四、應(yīng)用研究方向:生物化學(xué)和生物電化學(xué)納米材料的組裝和生物標(biāo)記生物芯片檢測納米藥物單分子檢測（一）、生物化學(xué)和生物電化學(xué)激光掃描共聚焦顯微鏡被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，只要擁有相應(yīng)的熒光探針，經(jīng)合理的設(shè)計(jì)，LSCM可用于對任何細(xì)胞結(jié)構(gòu)（生物膜、細(xì)胞器、染色體等）及分子（核酸、蛋白、脂類）、離子（Ca2+、K+、H+等）進(jìn)行定位、定量、實(shí)時、動態(tài)的觀測，同時還可測定分子擴(kuò)散、膜電位、氧化——還原狀態(tài)和配體結(jié)合等生化反應(yīng)變化程度。LSCM具有將形態(tài)學(xué)觀察、生理學(xué)動態(tài)監(jiān)測和三維圖像分析融為一體的“細(xì)胞CT”功能，可進(jìn)行細(xì)胞膜流動性，細(xì)胞間通訊的測定研究。利用LSCM技術(shù)，可以研究生物傳感器和生物大分子之間的作用（包括DNA分子相互作用、生物酶與DNA相互作用、蛋白分子相互作用、自組裝單分子膜等等）。

（一）、生物化學(xué)和生物電化學(xué)激光掃描共聚焦顯微鏡被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，只要擁有相應(yīng)的熒光探針，經(jīng)合理的設(shè)計(jì)，LSCM可用于對任何細(xì)胞結(jié)構(gòu)（生物膜、細(xì)胞器、染色體等）及分子（核酸、蛋白、脂類）、離子（Ca2+、K+、H+等）進(jìn)行定位、定量、實(shí)時、動態(tài)的觀測，同時還可測定分子擴(kuò)散、膜電位、氧化——還原狀態(tài)和配體結(jié)合等生化反應(yīng)變化程度。LSCM具有將形態(tài)學(xué)觀察、生理學(xué)動態(tài)監(jiān)測和三維圖像分析融為一體的“細(xì)胞CT”功能，可進(jìn)行細(xì)胞膜流動性，細(xì)胞間通訊的測定研究。利用LSCM技術(shù)，可以研究生物傳感器和生物大分子之間的作用（包括DNA分子相互作用、生物酶與DNA相互作用、蛋白分子相互作用、自組裝單分子膜等等）