牙膏對口腔硬組織安全評價的試驗方法-編制說明

牙膏對口腔硬組織安全評價的試驗方法（征求意見稿）編 制 說 明廣州寶潔有限公司二〇一九年三月1一研究背景口腔護理產(chǎn)品，包括牙膏和漱口水等，是目前大眾日常使用的自我口腔清潔的方式。在這些產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝中，有時為了配方的穩(wěn)定性或者活性物質的有效性而調節(jié)作為配方非常重要的因素 --配方的pH值。比如，臨床應用中的局部涂氟操作，產(chǎn)品配方的pH值會明顯的影響其防齲效果。過去數(shù)十年的研究發(fā)現(xiàn)，低pH值可以促進氟進入到口腔硬組織，從而提升防齲能力。目前市場已有的含酸化磷酸鹽氟化物的漱口水（pH3-4）以及含有亞錫氟的牙膏（pH4.5-6）均有長期的安全使用記錄，而其原理都是依據(jù)于上述發(fā)現(xiàn)。除此之外，有的產(chǎn)品因含有殺菌劑或者鈣和磷等活性物質，這些配方要求必須低pH，否則，會經(jīng)常出現(xiàn)因為高pH而導致的產(chǎn)品快速失活。因此，ISO標準關于口腔護理產(chǎn)品的pH已經(jīng)不設下限，pH指標并不能準確的反映產(chǎn)品的安全性。雖然有大量的臨床數(shù)據(jù)以及多年的市場經(jīng)驗證明低pH產(chǎn)品是安全的，但還是有些機構和組織會質疑pH值低于5.5的口腔護理產(chǎn)品的安全性，尤其目前隨著大眾與專家們對牙齒磨耗及牙齒酸蝕認識的提升，關于口腔硬組織對低 pH值的敏感性也越來越受關注，但因為安全評價方法的缺失而被大眾錯誤認識低pH的安全性。隨著新的研究手段的不斷更新，國內外科研人員開發(fā)出越來越多的對低pH值更為直接的評價硬組織安全的體外測量手段。因此，建立一個具有科學性、易操作、可區(qū)分已知安全產(chǎn)品和已知不安全產(chǎn)品、與已有的標準有關聯(lián)的、易于推廣的的安全評價方法勢在必行，具有重要的意義。通過閱讀相關文獻，與該領域的專家溝通合作，本研究確定采用循環(huán)法來測定低pH牙膏對口腔硬組織的安全性。主要研究內容包括：循環(huán)條件的優(yōu)化，檢測方法的評估等內容。二目的和意義在我國生產(chǎn)和銷售的牙膏都參考執(zhí)行國家標準 GB/T8372《牙膏》的要求，《牙膏》國標關于硬組織安全的指標依賴于 pH值的控制來實現(xiàn)，目前對于產(chǎn)品的要求是pH5.5-10，pH低于5.5的牙膏，產(chǎn)品責任方應提供按標準方法對口腔硬組織進行安全性評價的試驗報告。2近年來，隨時新技術的不斷進步，國內外市場逐步出現(xiàn)一些 pH值相對較低的產(chǎn)品，并且有長期安全使用記錄；與此同時，伴隨著新的研究手段的不斷更新，國內外科研人員開發(fā)出越來越多的低 pH值更為直接的評價硬組織安全的體外測量手段，如輪廓法、顯微硬度法等。在此形式下，急于更新我國對于口腔護理產(chǎn)品的硬組織安全評價方法，尤其是對于低 pH產(chǎn)品的安全評估顯得尤為重要。ISO11609:2017標準中采用的磨損值測試方法有放射性同位素實驗對應的RDA/REA法和表面輪廓儀對應的RDA-PE/REA-PE的兩種測試方法。其中RDA/REA法從提出到現(xiàn)在已有五六十年實踐歷史，方法成熟可靠是國際口腔行業(yè)公認的標準方法，至少有兩家國外檢測機構可以長期提供檢測服務。ISO11609:2017標準還引入的表面輪廓儀的方法，也可以達到與RDA/REA方法同當?shù)慕Y果。本項目所采用的方法與ISO11609:2017標準采用的方法相同，不涉及專利問題。循環(huán)法是在國際業(yè)界公認的傳統(tǒng)的脫礦再礦化測試方法上進行的改進，并在國際知名學術會議（2016IADR）上得到了專家的一致認可。三任務來源本標準是依據(jù)國家標準化管理委員會關于下達第四批推薦性國家標準計劃的通知國標委發(fā)函〔2018〕83號，計劃編號為20184493-T-607，項目名稱“牙膏對口腔硬組織安全評價的試驗方法”進行制定，主要起草單位：國家輕工業(yè)牙膏蠟制品質量監(jiān)督檢測中心、廣州寶潔有限公司，計劃完成時間 2020年。四主要工作過程（1）起草（草案、論證）階段2014年9月，成立了標準項目研究小組；2014年12月-2015年1月，形成方法的研究方案；2015年4月，形成標準初稿，確定方法驗證方案，進行方法驗證；2015年12月，完成方法驗證，提出循環(huán)法的修改方案并再次驗證，進行方法學評估；2016年5月，完成方法的驗證評估，形成標準草案（2）征求意見階段32018年12月-2019年4月：形成標準的征求意見稿，提交標準正文、編制說明、驗證報告，向技術委員會發(fā)布，公開征求委員意見。3）審查階段？？？4）報批階段？？？五標準編制原則和依據(jù)本標準編制遵循“先進性、實用性、統(tǒng)一性、規(guī)范性”的原則，盡可能與國際通行標準接軌，注重標準的可操作性，嚴格按照GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫規(guī)則》和GB/T20001.4-2001《標準編寫規(guī)則 第4部分：化學分析方法》的要求進行編寫。六標準的主要內容本標準包括表面輪廓法和循環(huán)法，都適用于牙膏對口腔硬組織（牙本質和牙釉質）的安全評價。牙釉質部分：在牛牙釉質塊上分別進行測試牙膏漿和對照牙膏漿的體外刷牙或循環(huán)浸泡實驗，模擬正常人群的日?？谇磺鍧嵭袨?。測試完成后， 體外刷牙實驗的釉質樣本使用輪廓儀進行檢測， 循環(huán)實驗的釉質樣本使用顯微硬度儀進行檢測，兩種檢測方法分別來評價釉質樣本測試前后表面形貌或顯微硬度改變，評估測試牙膏對牙釉質樣本的磨損或脫礦影響。使用輪廓儀測量牙釉質相對磨損值的方法是ISO中的REA-PE方法。牙本質部分：與牙釉質部分相似，既可用表面輪廓法，也可用循環(huán)實驗。在處理后的牛牙本質塊上分別進行測試牙膏漿和對照牙膏漿的體外刷牙或循環(huán)浸泡實驗，模擬正常人群的日常口腔清潔行為。測試完成后，體外刷牙實驗的牙本質樣本使用輪廓儀進行檢測，循環(huán)實驗的牙本質樣本使用顯微硬度儀進行檢測，兩種檢測方法分別來評價樣本測試前后牙本質樣品表面形貌或顯微硬度改變，評估測試牙膏對牙本質樣本的磨損或脫礦影響。用輪廓儀測量牙本質相對磨損值的方法是ISO中的RDA-PE方法。6.1 表面輪廓法引用ISO11609:2017Determinationofrelativedentifriceabrasivityto4enamelanddentinebyasurfaceprofilemethod表(面輪廓儀測試牙膏對牙釉質和牙本質的磨損)。本方法是基于使用輪廓儀測定刷牙后的摩損深度。 本方法已確定等效于放射性示蹤法，用于牙本質評估的方法被稱為 RDA-PE（RelativeDentinAbrasion–ProfilometerEquivalent,相對牙本質磨損-輪廓等效法），用于牙釉質評估的方法被稱為REA-PE(RelativeEnamelAbrasion–ProfilometerEquivalent)6.2 循環(huán)法 主要技術路線制備牙本質或者牙釉質樣品→測量牙齒樣品的表面顯微硬度基礎值并分組→配制牙膏漿→配制人工唾液→循環(huán)處理→測量牙齒樣品的處理后表面顯微硬度值→統(tǒng)計分析并評估安全性 循環(huán)模型的優(yōu)化 循環(huán)模型的選擇體外pH循環(huán)模型是研究脫礦再礦化經(jīng)典的體外模型，過去數(shù)十年中有上千篇文獻提到此模型，也是業(yè)界公認的研究脫礦再礦化的模型， 其結果與臨床實驗有一定的相關性，可以用體外 pH循環(huán)模型來預測臨床結果。胡德瑜教授提供的體外pH循環(huán)模型及其結果充分說明此模型可以用于評價牙膏的安全性。但在三家實驗室（寶潔，黑人，薇美姿）做驗證實驗時，大家的共識是體外pH循環(huán)模型操作起來程序復雜，需要耗費大量的人力以及時間。鑒于這個方法的主要目的為評估低pH牙膏的安全性，有別于單純研究脫礦再礦化能力，因此胡德瑜教授與寶潔聯(lián)合研究， 在保證實驗靈敏性重復性科學性的基礎上， 優(yōu)化并簡化循環(huán)過程，極大地提升了模型的操作性和可推廣性。優(yōu)化之后的循環(huán)模型如下所示：處理時間牙膏漿浸泡，(5mL/牙片)37度5分鐘重復DIWater充分清洗此步驟6次5人工唾液浸泡，(5mL/牙片) 37度55分鐘人工唾液浸泡，(5mL/牙片) 37度過夜在循環(huán)模型中，每次處理時牙膏漿的浸泡時間都是 5分鐘，這遠高于日常的刷牙時間（0-2分鐘），因此在循環(huán)模型是放大了牙膏對口腔硬組織的作用，如果低pH牙膏對硬組織有損害，那么此損害作用也是被放大的。 實驗對照的選擇日常飲食中的碳水化合物會有部分殘留在口腔，繼而被細菌代謝產(chǎn)生酸導致齲齒的產(chǎn)生；日常飲食中的酸性食物及飲料會直接導致硬組織脫礦。在循環(huán)法中，選擇水作為正對照，所有的測試產(chǎn)品不能劣于水，這是一個相對保守的對照，因為人們日常的健康飲食都會對牙齒造成一定的損傷，水是極端的存在。選擇水作對照也說明了循環(huán)法的條件嚴苛。循環(huán)法的負對照是1%檸檬酸溶液。這里的1%檸檬酸濃度甚至低于日常飲食中的水果及果汁飲料。所有的測試產(chǎn)品必須顯著優(yōu)于1%檸檬酸才算安全，也從另一個角度說明了循環(huán)法的嚴苛。 實驗底物的選擇循環(huán)法中使用牛牙作為實驗底物。 原因是人牙屬于人體器官，來源少， 且禁止買賣，僅限于科學研究。有大量文獻報道牛牙在組織成分及結構上與人牙相近，因此選擇牛牙作為實驗底物是具有科學性的。據(jù)文獻報道及實驗室數(shù)據(jù)證明， 牛牙的礦化程度和硬度是低于人牙的， 對pH的作用更敏感。因此在循環(huán)模型中用牛牙來代表人牙， 也是從底物的角度放大了低pH值牙膏對口腔硬組織的作用，從底物的角度表明了循環(huán)法的實驗條件嚴苛。 檢測方法的選擇1表面顯微硬度法（SurfaceMicrohardness,SMH ）硬度是牙釉質重要的物理性能之一。 SMH測量是目前測量釉質硬度的主要方法。顯微硬度儀測試時探頭垂直壓向脫礦標本的自然表面并停留一定時間，使之產(chǎn)生永久性形變，通過顯微鏡測量壓痕尺寸以確定牙體硬組織礦物含量。釉質的6顯微硬度能反映釉質的礦物質含量 ,SMH的變化可反映釉質礦物質的獲得和丟失。且SMH測定操作簡便，無需破壞樣本，已成為研究牙體硬組織的一個重要方法, 釉質顯微硬度也成為研究齲病的重要指標之一。在循環(huán)法中，顯微硬度可以準確地分辨出不同 pH值對牙本質和牙釉質的作用（圖 1a,1b），操作既簡便又科學，且重復性好，適合方法的普及與推廣。故在循環(huán)法中推薦使用的是顯微硬度法。72定量光激發(fā)熒光技術（Quantitativelight-inducedfluorescence ，QLF）QLF技術基礎源于熒光技術，牙體組織的釉牙本質界在單色光的照射下能夠被激發(fā)出不同光譜的熒光。因為脫礦釉質的晶體結構出現(xiàn)改變， 病損區(qū)釉質光線散射增多，阻礙外界光線到達病損區(qū)釉牙本質界以及釉牙本質界產(chǎn)生的熒光透過釉質到達牙齒表面，從而導致照射到釉牙本質界的熒光強度降低， 通過釉牙本質界激發(fā)出的綠色熒光量減少， 激發(fā)出的熒光通過脫礦釉質時散射量增多， 最終導致進入探測器的熒光減少。故正常釉質和早期脫礦釉質在誘導熒光強度方面存在著較大的差異。在QLF熒光照片中，正常的釉質區(qū)域表現(xiàn)為高亮度的黃綠色熒光，而包括齲損區(qū)在內的脫礦區(qū)域則表現(xiàn)為熒光減弱的暗區(qū)。 脫礦程度越明顯，該區(qū)發(fā)出的熒光強度越弱。在實際操作中發(fā)現(xiàn)如果使用 QLF，涂抹指甲油暴露操作區(qū)很容易污染牙面，以及因為指甲油的存在導致的拍照后軟件分析有誤差， 并且QLF所得參數(shù)的敏感請不如表面顯微硬度，對產(chǎn)品的區(qū)分度不如表面顯微硬度 （表1，圖2）。表1：表面顯微硬度和QLF對相同產(chǎn)品的不同評判83Micro-CTMicro-CT是利用X線掃描成像原理， 對樣品進行高分辨率非破壞性 3D成像的實驗設備。Micro-CT因為無創(chuàng)，并能獲得樣本的三維信息，已作為測評牙齒和骨組織密度的一項常規(guī)實驗手段。 同時作為一項檢測釉質和本質脫礦和再礦化前后礦物質密度改變的新型檢測方法， 在口腔硬組織研究中使用得也越來越多。其成像原理、基本結構和操作流程均與臨床使用的 CT非常相似，但因其使用了聚焦射線，針對體外的小樣本掃描，分辨率遠遠高于臨床螺旋 CT。以本實驗室用到的Micro-CTμ80為例，最高分辨率能達到 10μm。Micro-CT設備耗費較高，儀器體積大，不利于方法的推廣。 若想得到高分辨率的圖像，掃描時間很長，操作不易，上手困難。4掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope ，SEM）SEM廣泛用于牙體硬組織表面結構的觀察。掃描電鏡下能觀察出正常釉質呈規(guī)則緊密排列的釉柱外形，脫礦后增大的釉柱間隙以及釉柱中心晶體是否完好。SEM同樣體積龐大，耗費耗時都很高，且數(shù)據(jù)是半定量的圖片，不能定量。95橫斷顯微放射照相技術（ Transversemicro-radiography ，TMR）近幾十年來，許多學者的研究結果一致表明：TMR能夠成功地定量測定礦物質的損失量與獲得量以及礦物質的分布，是目前被廣泛接受的定量研究脫礦再礦化的“金標準“，常用該方法來評估新的齲損診斷技術。其原理是將標本制備成需要的厚度（牙釉質切片的厚度約為80-120um，牙本質約為200um），測量牙片段對單色X射線的吸收量，與同時暴露的標準參考物對比，通過測量標本的吸光度，專用軟件根據(jù)標本和梯形階梯影像的灰度級可自動計算得到脫礦深度和脫礦量：脫礦深度是指從標本表面到脫礦底部的距離；脫礦量是指正常釉質光密度痕跡與脫礦釉質光密度痕跡整合的表面積。因為諸多文獻表明TMR能夠成功的定量測定礦物質的損失量與獲得量并表征礦物質的分布，因此TMR是目前實用性最強、最被廣泛接受的評估牙齒硬組織脫礦與再礦化的方法。但是做TMR需要將牙片切成薄片，因為牙齒硬度高，切片技術限制了TMR的推廣。此外，TMR需要X射線儀，操作不便，可行性較低。統(tǒng)計方法基于實驗設計及已有的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計方法采用“非劣性檢驗”，即：測試產(chǎn)品不劣于正對照（DIWater）在95%置信水平下單邊檢驗，其中最小有效差異參考正對照與負對照的平均表面顯微硬度改變值的差異的一半。通過“非劣性檢驗”的分析， 目前市售的絕大部分產(chǎn)品都是檢驗合格的， 除了日本一款漱口水(表2)；還有目前市售的一些飲料，普通消費者認為健康的或者不會聯(lián)想到損害牙齒的，其實在循環(huán)法中， 經(jīng)過“非劣性檢驗”分析， 檢驗不合格（表3）。這與美國寶潔內部還未發(fā)表的原位實驗結果吻合。因此，在嚴苛的實驗條件下，通過嚴謹科學的統(tǒng)計分析，表明循環(huán)法及非劣性統(tǒng)計分析是可行的。表2：市售漱口水非劣性檢驗結果10表3：市售飲料的非劣性檢驗結果七方法實驗室驗證情況循環(huán)方法邀請了華西醫(yī)學院胡德瑜教授實驗室、 美國寶潔研發(fā)中心、北京寶潔研發(fā)中心、好來化工（中山）有限公司、廣州薇美資實業(yè)有限公司進行了方法驗證工作。ISO表面輪廓法循環(huán)方法邀請了第四軍醫(yī)大趙信義教授實驗室、 北京寶潔研發(fā)中心、廣州薇美資實業(yè)有限公