牙膏對(duì)口腔硬組織安全評(píng)價(jià)的試驗(yàn)方法-編制說明

牙膏對(duì)口腔硬組織安全評(píng)價(jià)的試驗(yàn)方法（征求意見稿）編 制 說 明廣州寶潔有限公司二〇一九年三月1一研究背景口腔護(hù)理產(chǎn)品，包括牙膏和漱口水等，是目前大眾日常使用的自我口腔清潔的方式。在這些產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝中，有時(shí)為了配方的穩(wěn)定性或者活性物質(zhì)的有效性而調(diào)節(jié)作為配方非常重要的因素 --配方的pH值。比如，臨床應(yīng)用中的局部涂氟操作，產(chǎn)品配方的pH值會(huì)明顯的影響其防齲效果。過去數(shù)十年的研究發(fā)現(xiàn)，低pH值可以促進(jìn)氟進(jìn)入到口腔硬組織，從而提升防齲能力。目前市場已有的含酸化磷酸鹽氟化物的漱口水（pH3-4）以及含有亞錫氟的牙膏（pH4.5-6）均有長期的安全使用記錄，而其原理都是依據(jù)于上述發(fā)現(xiàn)。除此之外，有的產(chǎn)品因含有殺菌劑或者鈣和磷等活性物質(zhì)，這些配方要求必須低pH，否則，會(huì)經(jīng)常出現(xiàn)因?yàn)楦遬H而導(dǎo)致的產(chǎn)品快速失活。因此，ISO標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于口腔護(hù)理產(chǎn)品的pH已經(jīng)不設(shè)下限，pH指標(biāo)并不能準(zhǔn)確的反映產(chǎn)品的安全性。雖然有大量的臨床數(shù)據(jù)以及多年的市場經(jīng)驗(yàn)證明低pH產(chǎn)品是安全的，但還是有些機(jī)構(gòu)和組織會(huì)質(zhì)疑pH值低于5.5的口腔護(hù)理產(chǎn)品的安全性，尤其目前隨著大眾與專家們對(duì)牙齒磨耗及牙齒酸蝕認(rèn)識(shí)的提升，關(guān)于口腔硬組織對(duì)低 pH值的敏感性也越來越受關(guān)注，但因?yàn)榘踩u(píng)價(jià)方法的缺失而被大眾錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)低pH的安全性。隨著新的研究手段的不斷更新，國內(nèi)外科研人員開發(fā)出越來越多的對(duì)低pH值更為直接的評(píng)價(jià)硬組織安全的體外測量手段。因此，建立一個(gè)具有科學(xué)性、易操作、可區(qū)分已知安全產(chǎn)品和已知不安全產(chǎn)品、與已有的標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)聯(lián)的、易于推廣的的安全評(píng)價(jià)方法勢(shì)在必行，具有重要的意義。通過閱讀相關(guān)文獻(xiàn)，與該領(lǐng)域的專家溝通合作，本研究確定采用循環(huán)法來測定低pH牙膏對(duì)口腔硬組織的安全性。主要研究內(nèi)容包括：循環(huán)條件的優(yōu)化，檢測方法的評(píng)估等內(nèi)容。二目的和意義在我國生產(chǎn)和銷售的牙膏都參考執(zhí)行國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T8372《牙膏》的要求，《牙膏》國標(biāo)關(guān)于硬組織安全的指標(biāo)依賴于 pH值的控制來實(shí)現(xiàn)，目前對(duì)于產(chǎn)品的要求是pH5.5-10，pH低于5.5的牙膏，產(chǎn)品責(zé)任方應(yīng)提供按標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)口腔硬組織進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)的試驗(yàn)報(bào)告。2近年來，隨時(shí)新技術(shù)的不斷進(jìn)步，國內(nèi)外市場逐步出現(xiàn)一些 pH值相對(duì)較低的產(chǎn)品，并且有長期安全使用記錄；與此同時(shí)，伴隨著新的研究手段的不斷更新，國內(nèi)外科研人員開發(fā)出越來越多的低 pH值更為直接的評(píng)價(jià)硬組織安全的體外測量手段，如輪廓法、顯微硬度法等。在此形式下，急于更新我國對(duì)于口腔護(hù)理產(chǎn)品的硬組織安全評(píng)價(jià)方法，尤其是對(duì)于低 pH產(chǎn)品的安全評(píng)估顯得尤為重要。ISO11609:2017標(biāo)準(zhǔn)中采用的磨損值測試方法有放射性同位素實(shí)驗(yàn)對(duì)應(yīng)的RDA/REA法和表面輪廓儀對(duì)應(yīng)的RDA-PE/REA-PE的兩種測試方法。其中RDA/REA法從提出到現(xiàn)在已有五六十年實(shí)踐歷史，方法成熟可靠是國際口腔行業(yè)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法，至少有兩家國外檢測機(jī)構(gòu)可以長期提供檢測服務(wù)。ISO11609:2017標(biāo)準(zhǔn)還引入的表面輪廓儀的方法，也可以達(dá)到與RDA/REA方法同當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。本項(xiàng)目所采用的方法與ISO11609:2017標(biāo)準(zhǔn)采用的方法相同，不涉及專利問題。循環(huán)法是在國際業(yè)界公認(rèn)的傳統(tǒng)的脫礦再礦化測試方法上進(jìn)行的改進(jìn)，并在國際知名學(xué)術(shù)會(huì)議（2016IADR）上得到了專家的一致認(rèn)可。三任務(wù)來源本標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)關(guān)于下達(dá)第四批推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃的通知國標(biāo)委發(fā)函〔2018〕83號(hào)，計(jì)劃編號(hào)為20184493-T-607，項(xiàng)目名稱“牙膏對(duì)口腔硬組織安全評(píng)價(jià)的試驗(yàn)方法”進(jìn)行制定，主要起草單位：國家輕工業(yè)牙膏蠟制品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心、廣州寶潔有限公司，計(jì)劃完成時(shí)間 2020年。四主要工作過程（1）起草（草案、論證）階段2014年9月，成立了標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目研究小組；2014年12月-2015年1月，形成方法的研究方案；2015年4月，形成標(biāo)準(zhǔn)初稿，確定方法驗(yàn)證方案，進(jìn)行方法驗(yàn)證；2015年12月，完成方法驗(yàn)證，提出循環(huán)法的修改方案并再次驗(yàn)證，進(jìn)行方法學(xué)評(píng)估；2016年5月，完成方法的驗(yàn)證評(píng)估，形成標(biāo)準(zhǔn)草案（2）征求意見階段32018年12月-2019年4月：形成標(biāo)準(zhǔn)的征求意見稿，提交標(biāo)準(zhǔn)正文、編制說明、驗(yàn)證報(bào)告，向技術(shù)委員會(huì)發(fā)布，公開征求委員意見。3）審查階段？？？4）報(bào)批階段？？？五標(biāo)準(zhǔn)編制原則和依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)編制遵循“先進(jìn)性、實(shí)用性、統(tǒng)一性、規(guī)范性”的原則，盡可能與國際通行標(biāo)準(zhǔn)接軌，注重標(biāo)準(zhǔn)的可操作性，嚴(yán)格按照GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》和GB/T20001.4-2001《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4部分：化學(xué)分析方法》的要求進(jìn)行編寫。六標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)包括表面輪廓法和循環(huán)法，都適用于牙膏對(duì)口腔硬組織（牙本質(zhì)和牙釉質(zhì)）的安全評(píng)價(jià)。牙釉質(zhì)部分：在牛牙釉質(zhì)塊上分別進(jìn)行測試牙膏漿和對(duì)照牙膏漿的體外刷牙或循環(huán)浸泡實(shí)驗(yàn)，模擬正常人群的日?？谇磺鍧嵭袨?。測試完成后， 體外刷牙實(shí)驗(yàn)的釉質(zhì)樣本使用輪廓儀進(jìn)行檢測， 循環(huán)實(shí)驗(yàn)的釉質(zhì)樣本使用顯微硬度儀進(jìn)行檢測，兩種檢測方法分別來評(píng)價(jià)釉質(zhì)樣本測試前后表面形貌或顯微硬度改變，評(píng)估測試牙膏對(duì)牙釉質(zhì)樣本的磨損或脫礦影響。使用輪廓儀測量牙釉質(zhì)相對(duì)磨損值的方法是ISO中的REA-PE方法。牙本質(zhì)部分：與牙釉質(zhì)部分相似，既可用表面輪廓法，也可用循環(huán)實(shí)驗(yàn)。在處理后的牛牙本質(zhì)塊上分別進(jìn)行測試牙膏漿和對(duì)照牙膏漿的體外刷牙或循環(huán)浸泡實(shí)驗(yàn)，模擬正常人群的日?？谇磺鍧嵭袨?。測試完成后，體外刷牙實(shí)驗(yàn)的牙本質(zhì)樣本使用輪廓儀進(jìn)行檢測，循環(huán)實(shí)驗(yàn)的牙本質(zhì)樣本使用顯微硬度儀進(jìn)行檢測，兩種檢測方法分別來評(píng)價(jià)樣本測試前后牙本質(zhì)樣品表面形貌或顯微硬度改變，評(píng)估測試牙膏對(duì)牙本質(zhì)樣本的磨損或脫礦影響。用輪廓儀測量牙本質(zhì)相對(duì)磨損值的方法是ISO中的RDA-PE方法。6.1 表面輪廓法引用ISO11609:2017Determinationofrelativedentifriceabrasivityto4enamelanddentinebyasurfaceprofilemethod表(面輪廓儀測試牙膏對(duì)牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的磨損)。本方法是基于使用輪廓儀測定刷牙后的摩損深度。 本方法已確定等效于放射性示蹤法，用于牙本質(zhì)評(píng)估的方法被稱為 RDA-PE（RelativeDentinAbrasion–ProfilometerEquivalent,相對(duì)牙本質(zhì)磨損-輪廓等效法），用于牙釉質(zhì)評(píng)估的方法被稱為REA-PE(RelativeEnamelAbrasion–ProfilometerEquivalent)6.2 循環(huán)法 主要技術(shù)路線制備牙本質(zhì)或者牙釉質(zhì)樣品→測量牙齒樣品的表面顯微硬度基礎(chǔ)值并分組→配制牙膏漿→配制人工唾液→循環(huán)處理→測量牙齒樣品的處理后表面顯微硬度值→統(tǒng)計(jì)分析并評(píng)估安全性 循環(huán)模型的優(yōu)化 循環(huán)模型的選擇體外pH循環(huán)模型是研究脫礦再礦化經(jīng)典的體外模型，過去數(shù)十年中有上千篇文獻(xiàn)提到此模型，也是業(yè)界公認(rèn)的研究脫礦再礦化的模型， 其結(jié)果與臨床實(shí)驗(yàn)有一定的相關(guān)性，可以用體外 pH循環(huán)模型來預(yù)測臨床結(jié)果。胡德瑜教授提供的體外pH循環(huán)模型及其結(jié)果充分說明此模型可以用于評(píng)價(jià)牙膏的安全性。但在三家實(shí)驗(yàn)室（寶潔，黑人，薇美姿）做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，大家的共識(shí)是體外pH循環(huán)模型操作起來程序復(fù)雜，需要耗費(fèi)大量的人力以及時(shí)間。鑒于這個(gè)方法的主要目的為評(píng)估低pH牙膏的安全性，有別于單純研究脫礦再礦化能力，因此胡德瑜教授與寶潔聯(lián)合研究， 在保證實(shí)驗(yàn)靈敏性重復(fù)性科學(xué)性的基礎(chǔ)上， 優(yōu)化并簡化循環(huán)過程，極大地提升了模型的操作性和可推廣性。優(yōu)化之后的循環(huán)模型如下所示：處理時(shí)間牙膏漿浸泡，(5mL/牙片)37度5分鐘重復(fù)DIWater充分清洗此步驟6次5人工唾液浸泡，(5mL/牙片) 37度55分鐘人工唾液浸泡，(5mL/牙片) 37度過夜在循環(huán)模型中，每次處理時(shí)牙膏漿的浸泡時(shí)間都是 5分鐘，這遠(yuǎn)高于日常的刷牙時(shí)間（0-2分鐘），因此在循環(huán)模型是放大了牙膏對(duì)口腔硬組織的作用，如果低pH牙膏對(duì)硬組織有損害，那么此損害作用也是被放大的。 實(shí)驗(yàn)對(duì)照的選擇日常飲食中的碳水化合物會(huì)有部分殘留在口腔，繼而被細(xì)菌代謝產(chǎn)生酸導(dǎo)致齲齒的產(chǎn)生；日常飲食中的酸性食物及飲料會(huì)直接導(dǎo)致硬組織脫礦。在循環(huán)法中，選擇水作為正對(duì)照，所有的測試產(chǎn)品不能劣于水，這是一個(gè)相對(duì)保守的對(duì)照，因?yàn)槿藗內(nèi)粘５慕】碉嬍扯紩?huì)對(duì)牙齒造成一定的損傷，水是極端的存在。選擇水作對(duì)照也說明了循環(huán)法的條件嚴(yán)苛。循環(huán)法的負(fù)對(duì)照是1%檸檬酸溶液。這里的1%檸檬酸濃度甚至低于日常飲食中的水果及果汁飲料。所有的測試產(chǎn)品必須顯著優(yōu)于1%檸檬酸才算安全，也從另一個(gè)角度說明了循環(huán)法的嚴(yán)苛。 實(shí)驗(yàn)底物的選擇循環(huán)法中使用牛牙作為實(shí)驗(yàn)底物。 原因是人牙屬于人體器官，來源少， 且禁止買賣，僅限于科學(xué)研究。有大量文獻(xiàn)報(bào)道牛牙在組織成分及結(jié)構(gòu)上與人牙相近，因此選擇牛牙作為實(shí)驗(yàn)底物是具有科學(xué)性的。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)證明， 牛牙的礦化程度和硬度是低于人牙的， 對(duì)pH的作用更敏感。因此在循環(huán)模型中用牛牙來代表人牙， 也是從底物的角度放大了低pH值牙膏對(duì)口腔硬組織的作用，從底物的角度表明了循環(huán)法的實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)苛。 檢測方法的選擇1表面顯微硬度法（SurfaceMicrohardness,SMH ）硬度是牙釉質(zhì)重要的物理性能之一。 SMH測量是目前測量釉質(zhì)硬度的主要方法。顯微硬度儀測試時(shí)探頭垂直壓向脫礦標(biāo)本的自然表面并停留一定時(shí)間，使之產(chǎn)生永久性形變，通過顯微鏡測量壓痕尺寸以確定牙體硬組織礦物含量。釉質(zhì)的6顯微硬度能反映釉質(zhì)的礦物質(zhì)含量 ,SMH的變化可反映釉質(zhì)礦物質(zhì)的獲得和丟失。且SMH測定操作簡便，無需破壞樣本，已成為研究牙體硬組織的一個(gè)重要方法, 釉質(zhì)顯微硬度也成為研究齲病的重要指標(biāo)之一。在循環(huán)法中，顯微硬度可以準(zhǔn)確地分辨出不同 pH值對(duì)牙本質(zhì)和牙釉質(zhì)的作用（圖 1a,1b），操作既簡便又科學(xué)，且重復(fù)性好，適合方法的普及與推廣。故在循環(huán)法中推薦使用的是顯微硬度法。72定量光激發(fā)熒光技術(shù)（Quantitativelight-inducedfluorescence ，QLF）QLF技術(shù)基礎(chǔ)源于熒光技術(shù)，牙體組織的釉牙本質(zhì)界在單色光的照射下能夠被激發(fā)出不同光譜的熒光。因?yàn)槊摰V釉質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變， 病損區(qū)釉質(zhì)光線散射增多，阻礙外界光線到達(dá)病損區(qū)釉牙本質(zhì)界以及釉牙本質(zhì)界產(chǎn)生的熒光透過釉質(zhì)到達(dá)牙齒表面，從而導(dǎo)致照射到釉牙本質(zhì)界的熒光強(qiáng)度降低， 通過釉牙本質(zhì)界激發(fā)出的綠色熒光量減少， 激發(fā)出的熒光通過脫礦釉質(zhì)時(shí)散射量增多， 最終導(dǎo)致進(jìn)入探測器的熒光減少。故正常釉質(zhì)和早期脫礦釉質(zhì)在誘導(dǎo)熒光強(qiáng)度方面存在著較大的差異。在QLF熒光照片中，正常的釉質(zhì)區(qū)域表現(xiàn)為高亮度的黃綠色熒光，而包括齲損區(qū)在內(nèi)的脫礦區(qū)域則表現(xiàn)為熒光減弱的暗區(qū)。 脫礦程度越明顯，該區(qū)發(fā)出的熒光強(qiáng)度越弱。在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)如果使用 QLF，涂抹指甲油暴露操作區(qū)很容易污染牙面，以及因?yàn)橹讣子偷拇嬖趯?dǎo)致的拍照后軟件分析有誤差， 并且QLF所得參數(shù)的敏感請(qǐng)不如表面顯微硬度，對(duì)產(chǎn)品的區(qū)分度不如表面顯微硬度 （表1，圖2）。表1：表面顯微硬度和QLF對(duì)相同產(chǎn)品的不同評(píng)判83Micro-CTMicro-CT是利用X線掃描成像原理， 對(duì)樣品進(jìn)行高分辨率非破壞性 3D成像的實(shí)驗(yàn)設(shè)備。Micro-CT因?yàn)闊o創(chuàng)，并能獲得樣本的三維信息，已作為測評(píng)牙齒和骨組織密度的一項(xiàng)常規(guī)實(shí)驗(yàn)手段。 同時(shí)作為一項(xiàng)檢測釉質(zhì)和本質(zhì)脫礦和再礦化前后礦物質(zhì)密度改變的新型檢測方法， 在口腔硬組織研究中使用得也越來越多。其成像原理、基本結(jié)構(gòu)和操作流程均與臨床使用的 CT非常相似，但因其使用了聚焦射線，針對(duì)體外的小樣本掃描，分辨率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于臨床螺旋 CT。以本實(shí)驗(yàn)室用到的Micro-CTμ80為例，最高分辨率能達(dá)到 10μm。Micro-CT設(shè)備耗費(fèi)較高，儀器體積大，不利于方法的推廣。 若想得到高分辨率的圖像，掃描時(shí)間很長，操作不易，上手困難。4掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope ，SEM）SEM廣泛用于牙體硬組織表面結(jié)構(gòu)的觀察。掃描電鏡下能觀察出正常釉質(zhì)呈規(guī)則緊密排列的釉柱外形，脫礦后增大的釉柱間隙以及釉柱中心晶體是否完好。SEM同樣體積龐大，耗費(fèi)耗時(shí)都很高，且數(shù)據(jù)是半定量的圖片，不能定量。95橫斷顯微放射照相技術(shù)（ Transversemicro-radiography ，TMR）近幾十年來，許多學(xué)者的研究結(jié)果一致表明：TMR能夠成功地定量測定礦物質(zhì)的損失量與獲得量以及礦物質(zhì)的分布，是目前被廣泛接受的定量研究脫礦再礦化的“金標(biāo)準(zhǔn)“，常用該方法來評(píng)估新的齲損診斷技術(shù)。其原理是將標(biāo)本制備成需要的厚度（牙釉質(zhì)切片的厚度約為80-120um，牙本質(zhì)約為200um），測量牙片段對(duì)單色X射線的吸收量，與同時(shí)暴露的標(biāo)準(zhǔn)參考物對(duì)比，通過測量標(biāo)本的吸光度，專用軟件根據(jù)標(biāo)本和梯形階梯影像的灰度級(jí)可自動(dòng)計(jì)算得到脫礦深度和脫礦量：脫礦深度是指從標(biāo)本表面到脫礦底部的距離；脫礦量是指正常釉質(zhì)光密度痕跡與脫礦釉質(zhì)光密度痕跡整合的表面積。因?yàn)橹T多文獻(xiàn)表明TMR能夠成功的定量測定礦物質(zhì)的損失量與獲得量并表征礦物質(zhì)的分布，因此TMR是目前實(shí)用性最強(qiáng)、最被廣泛接受的評(píng)估牙齒硬組織脫礦與再礦化的方法。但是做TMR需要將牙片切成薄片，因?yàn)檠例X硬度高，切片技術(shù)限制了TMR的推廣。此外，TMR需要X射線儀，操作不便，可行性較低。統(tǒng)計(jì)方法基于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及已有的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)方法采用“非劣性檢驗(yàn)”，即：測試產(chǎn)品不劣于正對(duì)照（DIWater）在95%置信水平下單邊檢驗(yàn)，其中最小有效差異參考正對(duì)照與負(fù)對(duì)照的平均表面顯微硬度改變值的差異的一半。通過“非劣性檢驗(yàn)”的分析， 目前市售的絕大部分產(chǎn)品都是檢驗(yàn)合格的， 除了日本一款漱口水(表2)；還有目前市售的一些飲料，普通消費(fèi)者認(rèn)為健康的或者不會(huì)聯(lián)想到損害牙齒的，其實(shí)在循環(huán)法中， 經(jīng)過“非劣性檢驗(yàn)”分析， 檢驗(yàn)不合格（表3）。這與美國寶潔內(nèi)部還未發(fā)表的原位實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。因此，在嚴(yán)苛的實(shí)驗(yàn)條件下，通過嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析，表明循環(huán)法及非劣性統(tǒng)計(jì)分析是可行的。表2：市售漱口水非劣性檢驗(yàn)結(jié)果10表3：市售飲料的非劣性檢驗(yàn)結(jié)果七方法實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證情況循環(huán)方法邀請(qǐng)了華西醫(yī)學(xué)院胡德瑜教授實(shí)驗(yàn)室、 美國寶潔研發(fā)中心、北京寶潔研發(fā)中心、好來化工（中山）有限公司、廣州薇美資實(shí)業(yè)有限公司進(jìn)行了方法驗(yàn)證工作。ISO表面輪廓法循環(huán)方法邀請(qǐng)了第四軍醫(yī)大趙信義教授實(shí)驗(yàn)室、 北京寶潔研發(fā)中心、廣州薇美資實(shí)業(yè)有限公