基因組與比較基因組學(xué)

第九章基因組與比較基因組學(xué)

9.1人工染色體構(gòu)建

9.2新的測(cè)序策略--全基因組鳥槍法測(cè)序

9.3全基因組序列分析--基因組學(xué)的新內(nèi)容

9.4

比較基因組學(xué)(Comparativegenomics)

9.1人工染色體構(gòu)建

1983年，美國(guó)的Dana-Farber癌癥研究所和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的教授首次在Nature上發(fā)表文章，報(bào)道了構(gòu)建YAC（YeastArtificialChromosome）庫(kù)的過(guò)程。1987年，Burke等人發(fā)現(xiàn)，僅僅帶有ARS序列(autonomousreplicatingsequence)的載體雖然能夠被復(fù)制，但極易在有絲分裂時(shí)丟失。即使在選擇培養(yǎng)基上，也只有5%-20%的子代細(xì)胞帶有ARS載體。加入Centromeres（CEN）能顯著提高ARS質(zhì)粒在有絲分裂時(shí)的穩(wěn)定性，90%以上子代細(xì)胞帶有該載體。CEN還能顯著降低拷貝數(shù)，從20-50/細(xì)胞降為1-2/細(xì)胞。（Science,236:806-812）。

人工染色體含有三種必需成分：著絲粒、端粒和復(fù)制起點(diǎn)。

著絲粒(CEN)位于染色體中央，呈紐扣狀結(jié)構(gòu)，在有絲分裂時(shí)結(jié)合微管并調(diào)控染色體的運(yùn)動(dòng)，也是姐妹染色單體配對(duì)時(shí)的最后位點(diǎn)，接收細(xì)胞信號(hào)而使姐妹染色體分開。

端粒（TEL）：主要功能是防止染色體融合、降解、確保其完整復(fù)制。端粒酶以其自身RNA為模板，在染色體端部添加上端粒重復(fù)序列，并參與端粒長(zhǎng)度和細(xì)胞增殖的調(diào)控。

復(fù)制起點(diǎn)：DNA復(fù)制通常由起始蛋白與特定的DNA序列相互作用開始。DNA合成的起始位點(diǎn)和DNA復(fù)制起點(diǎn)(遺傳位點(diǎn))所需的Cis靶區(qū)常位于同一段長(zhǎng)約100bp的DNA上。

YAC的主要缺點(diǎn)

1．存在高比例的嵌合體，即一個(gè)YAC克隆含有兩個(gè)本來(lái)不相連的獨(dú)立片段；

2．部分克隆子不穩(wěn)定，在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)中可能會(huì)發(fā)生缺失或重排；

3．難與酵母染色體區(qū)分開，因?yàn)閅AC與酵母染色體具有相似的結(jié)構(gòu)。

4．操作時(shí)容易發(fā)生染色體機(jī)械切割。

以細(xì)菌寄主系統(tǒng)為基礎(chǔ)的克隆載體形成嵌合體的頻率較低，轉(zhuǎn)化效率高，又易于分離。科學(xué)家用"染色體建造"法用F質(zhì)粒及其調(diào)控基因構(gòu)建細(xì)菌載體，克隆大片段DNA。該質(zhì)粒主要包括oriS，repE（控制F質(zhì)粒復(fù)制）和parA、parB（控制拷貝數(shù)）等成分。

BAC的優(yōu)點(diǎn)

1．易于用電擊法轉(zhuǎn)化E.coli（轉(zhuǎn)化效率比轉(zhuǎn)化酵母高10-100倍）；2．超螺旋環(huán)狀載體，易于操作；3．F‘質(zhì)粒本身所帶的基因控制了質(zhì)粒的復(fù)制；4．很少發(fā)生體內(nèi)重排。有人把人類染色體端粒DNA上單個(gè)α-衛(wèi)星DNA單元多聚化形成1Mb左右的大片段并與人類基因組DNA混合，產(chǎn)生了能被復(fù)制、能正常分裂并得到長(zhǎng)期穩(wěn)定保存的人工合成的染色體，長(zhǎng)度約為6-10Mb，稱為MAC或HAC。

9.2新的測(cè)序策略--全基因組鳥槍法測(cè)序

對(duì)某基因組文庫(kù)全部克隆片段進(jìn)行末端序列測(cè)定中未測(cè)到的堿基數(shù)，即缺口(gap)，與已測(cè)定的總堿基數(shù)相關(guān)。隨著已測(cè)定堿基數(shù)的增加，缺口的總堿基數(shù)目會(huì)按照泊松公式的一個(gè)推論（P=e-m）迅速減小。其中P為基因組中某個(gè)堿基未被測(cè)定的概率，m為所測(cè)定的堿基數(shù)與基因組大小相比的倍數(shù)。m越大P值越小。當(dāng)m值達(dá)到5（即隨機(jī)測(cè)定的堿基數(shù)達(dá)到基因組5倍時(shí)），基因組中未測(cè)定的堿基數(shù)為基因組總堿基數(shù)的0.67%(e-5=0.0067)。對(duì)流感嗜血桿菌這樣大的基因組(1.83Mb)，可能留有128個(gè)平均長(zhǎng)度為100bp的缺口。全基因組鳥槍法測(cè)序的主要步驟

第一，建立高度隨機(jī)、插入片段大小為2kb左右的基因組文庫(kù)?？寺?shù)要達(dá)到一定數(shù)量，即經(jīng)末端測(cè)序的克隆片段的堿基總數(shù)應(yīng)達(dá)到基因組5倍以上。第二，高效、大規(guī)模的末端測(cè)序。對(duì)文庫(kù)中每一個(gè)克隆，進(jìn)行兩端測(cè)序，TIGR在完成流感嗜血桿菌的基因組時(shí)，使用了14臺(tái)測(cè)序儀，用三個(gè)月時(shí)間完成了必需的28,463個(gè)測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序總長(zhǎng)度達(dá)6倍基因組。第三，序列集合。TIGR發(fā)展了新的軟件，修改了序列集合規(guī)則以最大限度地排除錯(cuò)誤的連鎖匹配。第四，填補(bǔ)缺口。有兩種待填補(bǔ)的缺口，一是沒(méi)有相應(yīng)模板DNA的物理缺口，二是有模板DNA但未測(cè)序的序列缺口。他們建立了插入片段為15-20kb的λ文庫(kù)以備缺口填補(bǔ)。

鳥槍法測(cè)序的缺點(diǎn)

對(duì)鳥槍法的改進(jìn)

(1)Clonecontig法。首先用稀有內(nèi)切酶把待測(cè)基因組降解為數(shù)百kb以上的片段，再分別測(cè)序。(2)靶標(biāo)鳥槍法(diretedshotgun)。首先根據(jù)染色體上已知基因和標(biāo)記的位置來(lái)確定部分DNA片段的相對(duì)位置，再逐步縮小各片段之間的缺口。一些常見(jiàn)的縮寫

SSLPs,simplesequencelengthpolymorphisms;

STRs,simpletandemrepeats;

SNPs,singlenucleotidepolymorphisms.

LINEs,longinterspersednuclearelements;

SINEs,shortinterspersednuclearelements;

LTR,longterminalrepeat.

FISH,FluorescentinsituHybridization;

STS,SequenceTaggedSite

EST,EndSequenceTag.9.3全基因組序列分析--基因組學(xué)的新內(nèi)容

1．?dāng)?shù)據(jù)存放。

2．堿基百分含量分析。無(wú)論是GC富含區(qū)還是AT富含區(qū)，都可能是一些特殊功能的區(qū)域。

肺炎支原體GC百分含量高和GC百分含量低的區(qū)域?qū)?yīng)于重組值較低的區(qū)域，包括著絲粒和端粒，而尿殖道支原體GC百分含量最低的區(qū)域?qū)?yīng)于rRNA和tRNA。流感嗜血桿菌GC百分含量高的區(qū)域也對(duì)應(yīng)于6個(gè)rRNA基因。

3.ORF分析。首先要用多個(gè)不同的軟件來(lái)要找到并估測(cè)基因組中的每一個(gè)ORF。

(1)通過(guò)流感嗜血桿菌能量代謝類群的ORF分析，了解到在這種生物中缺乏三羧酸循環(huán)(TCA)中必需的三個(gè)酶，即檸檬酸合成酶基因、異檸檬酸脫氫酶基因和順烏頭酸酶基因。由此推斷流感嗜血桿菌TCA缺失，不能合成谷氨酸，因?yàn)楣劝彼岬墓w是TCA的中間產(chǎn)生物α-酮戊二酸。

(2)在尿殖道支原體基因組中有一個(gè)稱為MgPa的ORF?？疾烊蚪M，共發(fā)現(xiàn)有9個(gè)與MgPa同源