山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新項(xiàng)目管理合同書

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目管理合同書（項(xiàng)目編號：9-031）項(xiàng)目名稱 歐李PSY基因克隆、表達(dá)和功能研究項(xiàng)目負(fù)責(zé)人 承擔(dān)單位 園藝學(xué)院 起止時(shí)間 2011.5—2012?4 填報(bào)日期2011年05月30日一、 項(xiàng)目研究內(nèi)容：1歐李PSY基因全長分離根據(jù)GeneBank中已登錄的PSY基因序列，設(shè)計(jì)簡并引物，利用同源序列法分離歐李果實(shí)PSY基因片段，再通過3’-RACE和5’RACE技術(shù)克隆歐李PSY基因3’-末端序列和5’-末端序列，最后進(jìn)行相關(guān)序列的拼接、組裝和分析，獲取歐李果實(shí)PSYcDNA全長序列；2歐李PSY基因生物信息分析利用生物信息工具和軟件對分離的PSY基因進(jìn)行生物信息學(xué)研究與分析，包括開放讀碼框分析、序列同源性比較、氨基酸疏水性分析、蛋白質(zhì)跨膜預(yù)測、信號肽序列分析、分子進(jìn)化樹構(gòu)建等；3歐李?，丫基因表達(dá)特性分析根據(jù)獲得的PSYcDNA全長序列，設(shè)計(jì)特異引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析PSY在歐李果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性，建立歐李果實(shí)發(fā)育過程中PSY基因的表達(dá)譜，探索歐李PSY基因在歐李果實(shí)類胡蘿卜素合成和積累過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律；4歐李PSY基因在大腸桿菌中的功能表達(dá)根據(jù)獲得的歐李PSYcDNA序列設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增歐李PSY開放讀碼框序列，將其克隆全原核表達(dá)載體pET-28a(+)，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-PSY；進(jìn)一步將pET-PSY轉(zhuǎn)入可合成和積累GGPP的工程大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，利用高效液相色譜(HPLC)分析工程大腸桿菌中類胡蘿卜素的合成和積累，從而對歐李PSY的功能特性進(jìn)行分析和鑒定。二、 總體方案及擬采用的研究方法和技術(shù)路線：1總體方案項(xiàng)目擬以我國特有果樹歐李為研究對象，利用RACE技術(shù)分離歐李果實(shí)類胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶基因psy，進(jìn)一步通過現(xiàn)代生物信息學(xué)分析、實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)及工程大腸桿菌異源表達(dá)體系等，對歐李psy基因的轉(zhuǎn)錄特性及功能特征進(jìn)行研究，以期為歐李果實(shí)類胡蘿卜素合成和積累的機(jī)制提供依據(jù)，也為今后改良?xì)W李果實(shí)色澤和提高歐李果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。2研究方法2.1試驗(yàn)材料收集試材選用山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝研究所選育的歐李(Cerasushumilis(Bge)Sok)優(yōu)良品種‘農(nóng)大4號’，從果實(shí)未成熟至完全成熟共分5個(gè)發(fā)育時(shí)期采集。樣品采集后迅速將果肉分離，液氮冷凍后置于-80°C保存?zhèn)溆茫?.2總RNA提取和cDNA合成采用TRIzol法提取果實(shí)總RNA，經(jīng)DNaseI37C處理1h以去除DNA污染。利用RevertAidTM-MuLV試劑盒(MBILithuania)將處理后的RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，具體參照試劑盒的操作說明書進(jìn)行；2.3PSY基因全長cDNA序列分離技術(shù)根據(jù)GeneBank已登錄的PSY基因保守序列區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物，以上述歐李果實(shí)cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得歐李PSY基因cDNA片段；通過RACE技術(shù)（RapidamplificationcDNAends）技術(shù)獲得歐李PSY基因cDNA5’和3’末端序列，拼接歐李PSY基因的全長cDNA序列，具體操作參照FirstChoiceTMRLM-RACEkits（Ambion,USA）說明進(jìn)行；2.4實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析基因表達(dá)根據(jù)上述獲得的歐李PSY基因cDNA序列，設(shè)計(jì)特異引物，利用7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI，USA）分析歐李PSY基因在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性；具體的操作參照Liu等（2007）的方法進(jìn)行；2.5歐李PSY基因在工程大腸桿菌體系中功能表達(dá)根據(jù)已獲得歐李PSY基因cDNA全長序列，設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增其開放讀碼框序列，克隆到大腸桿菌原核表達(dá)載體pET-28a（+），獲得原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-PSY。將重組質(zhì)粒pET-PSY轉(zhuǎn)入可合成和積累GGPP的大腸桿菌工程菌株中誘導(dǎo)表達(dá)，根據(jù)大腸桿菌工程菌株顏色的變化或HPLC測定類胡蘿卜素含量和組分的變化來鑒定歐李PSY蛋白的功能特性，具體的操作參照Cunningham等（1996）和Jayarai等（2007）的方法進(jìn)行。3技術(shù)路線項(xiàng)目擬采取的技術(shù)路線如圖所示。

姓名性別出生年月班級電話承擔(dān)任務(wù)男1991.03對整個(gè)項(xiàng)目的實(shí)施男1992.01歐李PSY基因全長分離女1989.06歐李PSY生物信息學(xué)分析男1989.06歐李PSY基因表達(dá)特性分析男1992.081歐李PSY基因在大腸桿菌中功能表達(dá)五、指導(dǎo)教師基本情況：項(xiàng)目負(fù)責(zé)人姓名性別男出生年月1974.04學(xué)位研究生學(xué)歷博士從事專業(yè)職稱副教授住址山西農(nóng)業(yè)大學(xué)家屬院畢業(yè)時(shí)間2009.12畢業(yè)學(xué)校華中農(nóng)業(yè)大學(xué)主要學(xué)術(shù)成就六、預(yù)期成果（論文、制作成品、實(shí)物等）及應(yīng)用情況：1預(yù)期成果1.1獲得歐李類胡蘿卜素合成關(guān)鍵酶基因psy全長序列；1.2建立工程大腸桿菌顏色互補(bǔ)和番茄遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)平臺；1.3在核心期刊上發(fā)表論文1-2篇。2應(yīng)用情況2.1本項(xiàng)目通過對參與類胡蘿卜素合成途徑中的重要酶基因psy的研究，對于從分子水平上認(rèn)識歐李類胡蘿卜素生物合成途徑、相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控以及相關(guān)酶的功能特性等問題具有重要的理論意義，同時(shí)本研究也為下步有目地的展開歐李果實(shí)“色澤育種”和品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)，也可為其它園藝作物品種改良提供新的思路和途徑，具有一定的應(yīng)有前景。2.2本項(xiàng)目研究獲得的歐李的psy類胡蘿卜素合成酶基因資源，可通過遺傳轉(zhuǎn)化的手段用于其它作物品質(zhì)改良，獲得富含胡蘿卜素的新品種；也可通過微生物發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)類胡蘿卜素，以滿足食品、化妝品及制藥等不同行業(yè)的需要，具有潛在的應(yīng)有價(jià)值。

七、資助經(jīng)費(fèi)用途（包括原材料、儀器設(shè)備、試驗(yàn)費(fèi)等、并列出明細(xì)）:經(jīng)費(fèi)預(yù)算（元）科目總預(yù)算經(jīng)費(fèi)擬申請學(xué)校資助計(jì)算依據(jù)與說明測試/計(jì)算/分析費(fèi)1000色譜測試、測試、弓1合物文獻(xiàn)費(fèi)1010資料印刷費(fèi)材料/試劑/藥品購置費(fèi)400400定量RT-PCR試劑、分子生物學(xué)試劑（盒）、載體、色譜級色素標(biāo)準(zhǔn)品等旅差費(fèi)500其它10090槍頭、離心管、采樣用品核準(zhǔn)資助經(jīng)費(fèi)額：500元八、簽約各方共同遵守的條款：1、 對合同執(zhí)行情況實(shí)行中期檢查，項(xiàng)目承擔(dān)方必須于通知時(shí)間內(nèi)提交中期進(jìn)展報(bào)告，并提出后續(xù)計(jì)劃。2、 合同完成后，項(xiàng)目承擔(dān)方必須按合同規(guī)定的內(nèi)容向甲方提交結(jié)題報(bào)告，并提供研究成果（論文、發(fā)表刊物原件、發(fā)明創(chuàng)造的樣品或成品、制作實(shí)物、圖片資料、參加課外科技競賽活動(dòng)的獲獎(jiǎng)證書復(fù)印件及其電子版資料）及完整的技術(shù)資料，甲方對乙方的技術(shù)訣竅、核心內(nèi)容有保守秘密的義務(wù)。本項(xiàng)目成果屬于學(xué)校。3、 乙方因故撤銷合同，或并非因不可抗拒的客觀原因致無法執(zhí)行合同時(shí)，應(yīng)視不同情況部分或全部退還所撥經(jīng)費(fèi)及物資、設(shè)備等。4、 合同所撥經(jīng)費(fèi)，應(yīng)按科研經(jīng)費(fèi)開支范圍的有關(guān)規(guī)定掌握使用，實(shí)行?？顚Ｓ谩?、 在合同執(zhí)行過程中，如需修改某