《基因芯片技術(shù)》第2章-基因芯片的制作

基因芯片技術(shù)Genechiptechnology1內(nèi)容提要：一、基因芯片制作方法概述二、芯片基片的制作三、探針的制備四、點樣儀與點樣過程五、原位合成法第2章生物芯片的制作2基因芯片的示意圖98-10-233498-10-235DNAChipTechnologySolidsupport(glass,membrane,plastic,silicon)MiniaturizedarrayofDNA(geneticmaterial)WorkonthebiochemicalprincipleofDNA/DNAhybridizationHybridizedprobes(DNAmolecules)arefluorescentlylabeled67ReferenceTestDNADNALabelfluorescentlybynicktranslation89LabonachipMicroarray98-10-231011探針：固定在支持介質(zhì)表面的DNA，稱為探針靶基因：樣本中經(jīng)標(biāo)記的DNA，稱為靶基因基因芯片的制作：原位合成法直接點樣法（合成后點樣）

一、基因芯片制作方法概述12原位合成與直接點樣法比較

CGH;comparativegenomichybridization，比較基因組雜交13點樣針（2003年統(tǒng)計結(jié)果）

14第二節(jié)芯片基片的制作基片：探針的支持物品選擇支持物（基片）要考慮的要素？

15選擇支持物（基片）時，要考慮的因素：1.液體在其表面的擴散性2.支持物固有的熒光背景3.表面添加的化學(xué)基團4.化學(xué)穩(wěn)定性和構(gòu)建的復(fù)雜性5.化學(xué)修飾和衍生的適應(yīng)性6.固定在支持物上的點的表面積7.最終產(chǎn)品的核酸承載能力和非特異性結(jié)合狀況

16一、常見的基片類型

1膜 2玻片3三維基質(zhì)包被玻片4微板型5集成電路型171.膜型硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚丙烯膜等。優(yōu)點：孔型三維結(jié)構(gòu)好，與核酸親和力強；雜交技術(shù)成熟；無需包被缺點：點樣密度低，需要更多探針；背景高；通常只能做單樣本雜交；靈敏度低，需要放射性物質(zhì)標(biāo)記等用途：診斷芯片，蛋白質(zhì)芯片這種類型“芯片”的點陣，是通過“點膜”形式制作的，并通過一定的方法使探針能夠牢固地結(jié)合于其上，整個過程類似于斑點雜交技術(shù)（如CloneTech公司）。182玻片優(yōu)點：耐高溫、高離子強度具有不侵潤性，使雜交體積小疏水表面樣品不易擴散，提高點樣密度熒光背景低價廉缺點：玻片表面要包被合適的功能基團，能將靶DNA片段固定用途：雙熒光、多系統(tǒng)熒光系統(tǒng)這種芯片的點陣是通過原位合成技術(shù)制作的，點陣密度很高，所以必須借助特殊的儀器對測定結(jié)果進行解讀和分析。當(dāng)前具有此類產(chǎn)品研制能力的公司很少（如Affimetrix公司）。193三維基質(zhì)包被玻片例如，將正電荷尼龍膜附著在玻片上例如，PerkinElmer公司在玻片表面包被一種專利集合物。優(yōu)點：與DNA結(jié)合能力更強，反應(yīng)更靈敏用途：多用在蛋白質(zhì)芯片中20微板型基因芯片4微板型這種芯片實質(zhì)上是一種具有高密度、小容量測試孔的小型酶聯(lián)免疫檢測板（如PE公司等）。

215集成電路型將雜交技術(shù)與微電子技術(shù)結(jié)合于一體，有目的地通過電子裝置檢測或控制DNA等生物大分子的作用過程（如Nanogen公司）。集成電路型基因芯片22二、探針分子與基片表面的作用方式化學(xué)偶聯(lián)：形成共價鍵物理吸附：通過次級鍵（如離子鍵）兩者共同作用探針：帶負電荷所以，基片表面要連接帶正電荷的基團固定率=共價結(jié)合的探針分子數(shù)量/共價結(jié)合和靜電結(jié)合的探針分子總量231氨基修飾玻片APS：γ-氨基丙基三乙氧硅烷242同型雙功能偶聯(lián)劑包被的基片同型雙功能偶聯(lián)劑：含有兩個相同的活性基團的化合物，兩個活性基團，一個連接氨基修飾玻片上的氨基，一個連接探針中的氨基前提：玻片要進行氨基修飾，探針也要進行氨基修飾同型雙功能偶聯(lián)劑：DSC、DSO、DMS等等253連接硫醇基修飾寡核苷酸的玻片前提：探針連接硫醇基修飾，即形成SH-oligo玻片氨基硅烷化表面修飾264環(huán)氧硅烷化前提：核苷酸氨基修飾特點：耐熱、不耐濕275聚酰氨胺樹形連接分子聚酰氨胺（PAMAM），樹形，固定率高28第三節(jié)探針的制備探針主要分三種：cDNA探針（互補DNA序列）——基因表達譜研究寡核苷酸探針（oligonucleotide）——基因表達譜研究基因組DNA探針（genoticDNA）等——比較基因組雜交

291cDNA探針制備1)來源于cDNA文庫提取mRNA——cDNA文庫——cDNA克隆測序驗證，選用唯一基因EST：表達序列標(biāo)簽，存在大量重復(fù)2）來源于IMAGEIMAGE：integratedmolecularanalysisofgenomeexpression1993年發(fā)起，旨在通過共享cDNA庫達到最終發(fā)現(xiàn)每一個基因的目的。目前，克隆數(shù)目達300多萬個，包括300多個人類文庫和100多個動物文庫，序列信息在NCBI的dbEST中，這些cDNA克隆構(gòu)建在質(zhì)粒載體上，并都已經(jīng)測序驗證，可以通過PCR擴增得到。302寡核苷酸探針采用原位合成和合成后點樣固定兩種方法合成方法：傳統(tǒng)的DNA合成方法合成后點樣方式：制備DNA，要進行5’氨基修飾，并設(shè)計一個手臂分子Oligo-10dT-NH2-5’；60-70bp，選取特異性高的片段商業(yè)化的寡核苷酸探針：人，小鼠，大鼠，酵母，瘧原蟲等比如，全基因組寡核苷酸探針。8327人類基因，5002個小鼠基因，近4000個的大鼠基因313基因組DNA探針BAC基因組文庫微陣列YAC基因組文庫微陣列外顯子陣列32第四節(jié)點樣儀及點樣過程

一、接觸式點樣法1實心針“復(fù)制器”實心針侵入源板中蘸取樣品，提起后在針的頂端形成一定體積的液滴，移動到玻片相應(yīng)位置上，接觸基片把樣品轉(zhuǎn)移，形成樣點。不斷重復(fù)這一過程，直到完成。特點：取樣一次，點樣一次芯片上的點距離源樣品距離不一樣，樣品蒸發(fā)使得點樣直徑不同需要嚴(yán)格控制濕度，但濕度太高影響樣品干燥

33342鵝毛筆針和裂隙針毛細原理：在細縫中形成一段樣品的液柱，然后在三維工作平臺作用下轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的位點，向下輕觸玻片，將一定體積液體轉(zhuǎn)移，形成樣點。特點：細縫容易堵353毛細管筆不用每次取樣，但是也愛堵364針與環(huán)結(jié)構(gòu)環(huán)取樣，針點樣沒有死腔，不會造成樣品殘留，無污染不堵樣點均一缺點：用樣品多，樣品濃度隨時間增加而變濃372202芯片點樣儀

生產(chǎn)商Bio-Rad

性能介紹分辨率：1.25um(x，y軸)和0.25um(Z軸)，重復(fù)性：3um球面精確性：l0um一次制成芯片數(shù)：126塊芯片每塊玻片點樣量>82,000個點

383940合成后點樣板41二、非接觸式點樣法

壓電打印原位聚合技術(shù)其裝置與普通的彩色噴墨打印機并無兩樣，所用技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方法。即，將墨盒中的墨汁分別用四種堿基合成試劑替代，支持物經(jīng)過包被后，通過計算機控制噴墨打印機，將特定種類的試劑噴灑到預(yù)定的區(qū)域上。沖洗、去保護、偶聯(lián)等則同于一般的固相原位合成技術(shù)。如此類推，可以合成出長度為40到50個堿基的探針。優(yōu)點：設(shè)備廉價，技術(shù)相對簡單，反應(yīng)產(chǎn)率高缺點：點陣密度低，易產(chǎn)生交叉污染42把探針固定在玻璃表面封閉玻片未點樣的區(qū)域：防止雜交時與樣品DNA非特異性結(jié)合。三、點樣后處理43第五節(jié)原位合成法

一、原位光刻合成由美國Affymetrix公司開發(fā)44

步驟：1）把玻璃基片上的活性羥基修飾上光保護基團，此光保護基團可被一定波長的光激活并脫保護。2）根據(jù)所要制作的陣列的需要設(shè)計光刻掩膜。將掩膜（M1）覆蓋在修飾過的基片上，用光照射使曝光區(qū)域的基片表面脫除保護基團而形成活性羥基（1-2）。3）引入5`端被X基團保護、3`端被活化的單核苷酸dNTP，使dNTP的3`端與基片上的活性羥基縮合，洗去未有效結(jié)合的dNTP（3）。4）更換掩膜M2，重復(fù)1-2，直到所需要的探針陣列合成完畢（4-6）。

45PeterJ.Russell,iGenetics:Copyright?PearsonEducation,Inc.,publishingasBenjaminCummings.Affymetrixarraysynthesis46Affymetrix芯片介紹GeneChip以邊長12.7cm(5英寸)的正方形石英片為材料，進行生產(chǎn)。石英片是天然羥基化的基質(zhì)，表面均勻的羥基化具有結(jié)合其它化合物的良好特性。硅烷化石英片：硅烷膜為探針合成提供密度均勻的羥基；附著在硅烷膜上的連接分子則提供了可以在空間上被光激活的表面。

硅烷分子間的距離決定了探針的固定密度，可以在邊長1.28cm正方形的面積上固定大于500,000（50萬）個探針位點(feature)，每一個位點上容納了數(shù)百萬個相同的DNA分子。47當(dāng)合成過程全部完成之后，石英片去除保護基團，切割成小塊，每一塊即為一張芯片。每張芯片被裝在一個塑料艙中，便于貯存和操作，同時也提供了在掃描儀中精確、重復(fù)定位芯片的裝置。樣品室深1mm，可以容納200μL雜交液體。48Affymetrix原位合成優(yōu)點序列可精確控制生產(chǎn)快速高密度（可達40萬點/1.6平方厘米）共價交聯(lián)固定缺點設(shè)備昂貴片段短（25mer)，適合再測序合成過程中大量不完全片斷殘留在基片上設(shè)計工作量大（合成大量蔽光膜），芯片更新慢49探針問題光導(dǎo)原位合成法需要預(yù)選設(shè)計、制造一系列蔽光掩膜，造價較高；制造過程中采用光脫保護方式，掩膜孔徑較小時會發(fā)生光衍射現(xiàn)象，制約了探針密度的進一步提高，而且光脫保護不徹底，每步產(chǎn)率只有92-94%，因此這種方法只能合成30nt左右的寡核苷酸探針，同時探針區(qū)域由于存在大量不成功的合成片段，造成雜交背景較高，不適于定量檢測。更新慢，而舊的數(shù)據(jù)庫中有的序列有錯誤50NimbleGen

MasklessArraySynthesis（MAS）NimbleGen公司Nimble：聰明人MasklessArraySynthesis（MAS）無掩膜合成技術(shù)：包括無掩膜的投射儀、反應(yīng)倉、電腦、DNA合成儀。數(shù)字微鏡晶片（DMD），利用微小的氧化鋁鏡片（相當(dāng)于頭發(fā)直徑的1/5）陣列反射多達786000個單一像素光線構(gòu)成的光束，數(shù)字微鏡晶片相當(dāng)于掩膜。氧化鋁鏡片陣列每一片的角度都可以控制，使反射光強度不同。51數(shù)字微鏡晶片反射一定圖案的紫外光到基片上，形成光暗相間的部分，亮的位點光敏基團去保護，發(fā)生核苷酸偶聯(lián)，暗的位點光敏基團保持不變52本章小結(jié):1掌握基因芯片的概念、特點、使用基因芯片的流程2掌握生物芯片分類3了解蛋白芯片、組織芯片和微流控芯片4了解如何在各種“組學(xué)”研究中應(yīng)用生物芯片技術(shù)5了解基因芯片技術(shù)的瓶頸及發(fā)展方向53思考題：1基因芯片的制作方法有哪些？2基因芯片的基片種類有哪些？3選擇芯片時應(yīng)考慮哪些