熒光定量核酸檢測(cè)技術(shù)

關(guān)于熒光定量核酸檢測(cè)技術(shù)第一頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日主要表現(xiàn)為PCR產(chǎn)物分析手段落后：

瓊脂糖凝膠電泳法只能判斷產(chǎn)物片段大小，并不能鑒別產(chǎn)物特異性。造成傳統(tǒng)PCR檢測(cè)缺點(diǎn)非特異性難以判斷、假陽(yáng)性多和重復(fù)性差等。實(shí)驗(yàn)室管理制度落后；人員培訓(xùn)水平落后；國(guó)內(nèi)PCR市場(chǎng)存在的問(wèn)題第二頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日反相膜雜交技術(shù)復(fù)星微孔板雜交技術(shù)復(fù)星、華美、復(fù)華、浩源、錦宏熒光PCR技術(shù)復(fù)星、達(dá)安、匹基國(guó)內(nèi)發(fā)展的核酸檢測(cè)新技術(shù)第三頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日反相膜雜交技術(shù)原理首先將特異性探針交聯(lián)在固相載體膜上，這時(shí)載體膜以及膜上的探針相當(dāng)于固定相，當(dāng)膜條的一端與帶有雜交反應(yīng)物的液面接觸時(shí)，帶有生物素標(biāo)記的基因片段、標(biāo)記酶、酶底物依次通過(guò)這個(gè)固定點(diǎn)時(shí)，其表現(xiàn)的效應(yīng)行為類似于過(guò)濾或者是親和層析，這時(shí)探針有機(jī)會(huì)與流動(dòng)相中的靶序列充分作用特異性結(jié)合（雜交），再經(jīng)過(guò)酶顯色最終顯示出藍(lán)紫色斑點(diǎn)。第四頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日反相膜雜交原理示意圖第五頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日主要優(yōu)點(diǎn)：1.操作簡(jiǎn)便；2.無(wú)特殊設(shè)備要求；

3.適合于分型；4.結(jié)果可原始保存。主要缺點(diǎn)：只能進(jìn)行半定量操作第六頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日微孔板雜交技術(shù)原理具體來(lái)講，用生物素（Biotin）標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與固定在酶標(biāo)板上的鏈霉親合素（Streptavidin，SA）結(jié)合，再與抗原標(biāo)記的特異性HBV探針進(jìn)行正向法雜交。產(chǎn)物通過(guò)探針連接的抗體酶識(shí)別基團(tuán)和標(biāo)記堿性磷酸酶的抗體特異結(jié)合后，酶催化底物，在酶標(biāo)板中顯出顏色，通過(guò)酶標(biāo)儀讀取光吸收值。第七頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日微孔板雜交技術(shù)原理示意圖第八頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日主要優(yōu)點(diǎn)：

1.雜交部分操作類似于ELISA，實(shí)驗(yàn)人員較熟悉；

2.可向全自動(dòng)過(guò)度；

3.可定量操作。主要缺點(diǎn)：

1.分型困難；

2.試劑成本較高；

3.操作較復(fù)雜。第九頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日熒光PCR技術(shù)原理熒光PCR試劑比常規(guī)PCR試劑多一個(gè)寡聚核苷酸探針，這個(gè)探針帶有一個(gè)熒光發(fā)光分子和一個(gè)熒光淬滅分子，完整的探針在激發(fā)光激發(fā)下，發(fā)光分子所產(chǎn)生的熒光被淬滅分子全部吸收，樣品無(wú)熒光。而PCR過(guò)程中。Taq酶分子在鏈延長(zhǎng)過(guò)程中可以通過(guò)自身的5’3’核酸外切酶降解與模板結(jié)合的特異性熒光探針，使得熒光發(fā)光分子從探針上切下來(lái)而與熒光淬滅分子分開，從而在激發(fā)光激發(fā)下產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光，這種熒光隨著PCR擴(kuò)增過(guò)程而動(dòng)態(tài)增強(qiáng)。第十頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日熒光PCR技術(shù)原理示意圖第十一頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日主要優(yōu)點(diǎn)：

1.能對(duì)靶基因進(jìn)行定量檢測(cè)；

2.在封閉狀態(tài)下進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)，減少了污染機(jī)會(huì)。主要缺點(diǎn)：

1.儀器設(shè)備昂貴，不利于推廣；

2.分型困難。第十二頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置為了防止由標(biāo)本（微生物或非微生物）和靶核酸模板以及經(jīng)PCR擴(kuò)增的靶核酸片段所引起的交叉污染，核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)設(shè)置三個(gè)專用的實(shí)驗(yàn)室。前PCR區(qū)1（試劑配制實(shí)驗(yàn)室）

用途：該實(shí)驗(yàn)室是無(wú)臨床標(biāo)本和無(wú)核酸污染區(qū)，用于配制各類試劑及設(shè)置PCR擴(kuò)增反應(yīng)管無(wú)（靶核酸模板）。

基本設(shè)備：1.實(shí)驗(yàn)應(yīng)有紫外燈；2.PCR防污染罩；

3.冰箱（4℃，-20℃）；4.臺(tái)式小型高速離心機(jī)、旋渦振蕩器、各種規(guī)格移液器（0-10ul、40-200ul、50-1000ul）等；5.高壓滅菌的各種Eppendorf管和移液器吸嘴；6.專用文具用品；7.實(shí)驗(yàn)桌椅（實(shí)驗(yàn)臺(tái)臺(tái)面防酸、防堿和耐熱）；8.自來(lái)水設(shè)備第十三頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日前PCR區(qū)2（標(biāo)本制備實(shí)驗(yàn)室）用途：該實(shí)驗(yàn)室用于分離和抽提病原微生物中的核酸，防止因標(biāo)本處理而引起的實(shí)驗(yàn)室感染和檢測(cè)的交叉污染。基本設(shè)備：1.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有紫外燈；2.超凈臺(tái)或PCR防污染罩；3.冰箱（4℃，-20℃）；4.高壓滅菌器(處理傳染性標(biāo)本和物品)；5.高速和低速離心機(jī)、旋渦振蕩器、各種規(guī)格移液器（0-10ul、40-200ul、50-1000ul）等；6.高壓滅菌的各種Eppendorf管和移液器吸嘴；7.專用文具用品；8.救護(hù)藥箱，包括外傷用藥，眼睛沖洗液等；9.實(shí)驗(yàn)桌椅（實(shí)驗(yàn)臺(tái)臺(tái)面防酸、防堿和耐熱）；10.電話機(jī)（備有關(guān)臨床醫(yī)生的電話號(hào)碼，以便因突發(fā)事件及時(shí)聯(lián)系）；11.自來(lái)水設(shè)備。第十四頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日后PCR區(qū)（擴(kuò)增和分析實(shí)驗(yàn)室）用途:該實(shí)驗(yàn)室用進(jìn)行PCR擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的各類分析操作。

基本設(shè)備：1.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)有紫外燈；2.各類PCR擴(kuò)增儀；3.電泳儀、電泳槽、紫外分析儀；4.照相設(shè)備或凝膠分析系統(tǒng)；5.臺(tái)式小型高速離心機(jī)、孵育箱（水浴或恒溫）；6.冰箱（4℃、-20℃）；7.微波爐；8. 配套移液器（若干）；9.高壓滅菌的各種Eppendorf管和移液器吸嘴。10. 電腦和專用文具用品、救護(hù)藥箱；11.實(shí)驗(yàn)桌椅（實(shí)驗(yàn)臺(tái)臺(tái)面防酸、防堿和耐熱）；12. 自來(lái)水設(shè)備;13.其他儀器：根據(jù)檢測(cè)方法不同而定。第十五頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日定量技術(shù)比較第十六頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日第十七頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日試劑盒的檢測(cè)靈敏度第十八頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)HBV-DNA結(jié)果

與臨床的關(guān)系第十九頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日經(jīng)統(tǒng)計(jì)，X2=1.15，P<0.05，表明在HBsAg/HBeAg/抗HBc陽(yáng)性和HBsAg/抗HBe/抗HBc陽(yáng)性組中病毒載量的差異顯著，HBVDNA和HBeAg密切相關(guān)。該定量結(jié)果能夠反映在這兩種血清學(xué)模式中病毒DNA的復(fù)制情況，對(duì)于臨床輔助診斷有重要作用。表.在HBsAg/HBeAg/抗HBc陽(yáng)性和HBsAg/抗HBe/抗HBc陽(yáng)性組中病毒載量頻數(shù)分布

第二十頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日慢性肝炎患者干擾能治療過(guò)程中病毒核酸

的動(dòng)態(tài)變化

上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院傳染科（200025）

羅振輝厲惠莉高健張東華摘要：本文采用探針雜交定量檢測(cè)HBV-DNA，動(dòng)態(tài)檢測(cè)了15例慢性乙肝患者干擾能治療前、后和治療過(guò)程中的HBV-DNA的變化，除見(jiàn)干擾能抑制病毒復(fù)制的作用外，且HBV-DNA的變化較eAg陰轉(zhuǎn)和ALT下降更敏感、更確切的反映了干擾能的療效。干擾能療效的個(gè)體差異甚大，似和機(jī)體感染的嚴(yán)重程度及自身的清除能力有關(guān)，HBV-DNA的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，結(jié)合eAg和ALT的變化，可有助于決定適當(dāng)?shù)膭┝亢秃侠淼寞煶?。第二十一?yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日

部分討論：15例病人中eAg均為陽(yáng)性，但HBV-DNA值的差異甚大，從1.768Meq/ml到4800Meq/ml，該值更確切的反映了機(jī)體的感染狀態(tài)，其高低可能與感染的嚴(yán)重程度及病毒復(fù)制的活躍情況呈正相關(guān)；與機(jī)體免疫清除的時(shí)間和強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)。高值示感染嚴(yán)重或清除無(wú)力；反之表示感染較輕或清除強(qiáng)力。實(shí)驗(yàn)表明HBV-DNA低值者療效較佳；無(wú)論HBV-DNA值是高是低，治療后HBV-DNA均見(jiàn)一定程度下降，其下降的幅度與病例的選擇；eAg的陰轉(zhuǎn)率6個(gè)月時(shí)為8/15，和國(guó)內(nèi)外諸多報(bào)告大致相似，此變化和HBV-DNA值的低下基本吻合，但HBV-DNA值在6個(gè)月時(shí)已有9例小于0.7Meq/ml，且見(jiàn)HBV-DNA的變化大多早于eAg的陰轉(zhuǎn)，一般提早2個(gè)月，個(gè)別提前4個(gè)月，可見(jiàn)HBV-DNA值的檢測(cè)遠(yuǎn)較觀察eAg更敏感、更確切的反映了干擾能抗病毒的作用。第二十二頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日ALT的變化通常也是評(píng)估干擾能治療的重要指標(biāo)，本組病例6個(gè)月時(shí)ALT下降至正常者為11/15（73.3%），無(wú)明顯變化或升高者為4/15，此變化和HBeAg的陰轉(zhuǎn)大致吻合，但和HBV-DNA低下并非完全一致。2號(hào)病例持續(xù)用藥至8個(gè)月時(shí)ALT明顯升高，繼續(xù)減量用藥后，HBV-DNA低下，有力的說(shuō)明了ALT升高是機(jī)體清除病毒的正常表現(xiàn)，故以ALT復(fù)常為評(píng)估指標(biāo)應(yīng)有辨證的觀點(diǎn)。結(jié)論：HBV-DNA值的變化充分反映了干擾能抑制病毒復(fù)制的作用明顯，且HBV-DNA的變化較eAg陰轉(zhuǎn)和ALT下降更敏感、更確切的反映了干擾能的療效。對(duì)于每一病例應(yīng)具體分析，力爭(zhēng)以HBV-DNA值作為觀察療效的指標(biāo)，決定適當(dāng)?shù)膭┝?，反?fù)或更長(zhǎng)的療程，也許是未來(lái)抗病毒治療的方向。第二十三頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日對(duì)HBV抗病毒治療的定量檢測(cè)建議針對(duì)拉米夫定治療乙型肝炎的定量檢測(cè)建議針對(duì)干擾素治療乙型肝炎的定量檢測(cè)建議可以研究聯(lián)合用藥，并用定量檢測(cè)來(lái)評(píng)估療效第二十四頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日針對(duì)拉米夫定治療乙型肝炎的定量檢測(cè)建議

根據(jù)《拉米夫定臨床應(yīng)用指導(dǎo)意見(jiàn)》（由“拉米夫定臨床應(yīng)用專家指導(dǎo)小組”制定），我們提出了以下對(duì)乙型肝炎病人的定量檢測(cè)建議：病人的選擇：HBVDNA定量檢測(cè)；觀察項(xiàng)目及隨訪：血清病毒學(xué)標(biāo)志：HBeAg，抗HBe，HBVDNA，治療目標(biāo)和療效判斷：病毒學(xué)標(biāo)志改善：HBV-DNA陰轉(zhuǎn)（斑點(diǎn)雜交或定量法降低>2log10）;停藥標(biāo)準(zhǔn)：達(dá)顯效病人，繼續(xù)用藥3-6個(gè)月，仍為顯效者，可停藥；停藥后，繼續(xù)隨訪觀察6-12個(gè)月，每3-6個(gè)月復(fù)查HBVDNA。第二十五頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日丙型肝炎病毒的核酸檢測(cè)丙肝：輸血后肝炎主要原因急性期2－26周（平均7.4周） 潛伏期1－2個(gè)月酶免檢出率：1月17.4％

2－6月60－80％

1年80％病毒特點(diǎn)：滴度低；免疫反應(yīng)弱；變異快第二十六頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日HCV病毒載量監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)在常規(guī)病人護(hù)理中扮演的角色開始治療改變治療方案選擇治療方案確證療效第二十七頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日通過(guò)監(jiān)測(cè)HCV病毒滴度反映療效WeeksMedianHCVRNA(copies/ml)第二十八頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日IFN-單次給藥后HCV-1病毒滴度變

化的定量監(jiān)測(cè)N=32genomes/ml*1million第二十九頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日淋病雙球菌（NG）的核酸檢測(cè)標(biāo)本取材：男性：作尿道擠壓和前列腺按摩以取得尿道口分泌物女性：宮頸口分泌物診斷方法：

1、涂片染色：在中性粒細(xì)胞中尋找革蘭氏陰性的雙球菌簡(jiǎn)便易行，但靈敏度不高，女性病人檢出率僅50%左右

2、分離培養(yǎng)：WHO推薦培養(yǎng)較困難，生化鑒定復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)

3、ELISA檢測(cè)抗原存在交叉反應(yīng)第三十頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日由于PCR具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于淋病的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。利用PCR可以幫助解決的主要問(wèn)題有：（1）對(duì)分離培養(yǎng)的菌株進(jìn)行鑒定和進(jìn)一步分析。（2）提高檢測(cè)臨床標(biāo)本的陽(yáng)性率和準(zhǔn)確性。（3）用于抗生素治療的療效觀察。（4）對(duì)淋球菌菌株進(jìn)行分子流行病學(xué)分析。第三十一頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日沙眼衣原體（CT）的核酸檢測(cè)標(biāo)本取材：同淋球菌在非淋性尿道炎中，由衣原體引起的占50%以上，健康人群約有10%感染率。診斷方法：（1）細(xì)胞培養(yǎng)繁瑣、費(fèi)時(shí)，且培養(yǎng)條件不適、標(biāo)本運(yùn)送不當(dāng)、標(biāo)本不足等因素均可影響檢測(cè)敏感度。（2）免疫熒光法、酶聯(lián)免疫法簡(jiǎn)便快速，但靈敏度和特異性均低于培養(yǎng)法。第三十二頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日應(yīng)用PCR檢測(cè)方法靈敏度、特異性可達(dá)94~100%，可做