堿性磷酸酶的動力學(xué)分析

實驗四

堿性磷酸酶的動力學(xué)分析酶促反應(yīng)動力學(xué)：研究酶促反應(yīng)速度及其影響因素，并加以定量的闡述。影響因素：酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。

在研究某種因素對酶促反應(yīng)速度的影響時，其余各因素均需保持恒定。一、實驗?zāi)康?.掌握ALP活性測定的原理與方法2.觀察溫度、pH、底物濃度、抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響。3.掌握雙倒數(shù)作圖法測定km值的原理與方法。二、實驗原理1.溫度對酶促反應(yīng)速度的影響2.pH對酶促反應(yīng)速度的影響3.底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響4.抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響5.酶活性的測定1.溫度對酶促反應(yīng)速度的影響溫度對酶促反應(yīng)速率具有雙重影響酶的最適溫度酶的最適溫度不是酶的特征性常數(shù)，它與反應(yīng)所需時間有關(guān)溫度對淀粉酶活性的影響2.pH對酶促反應(yīng)速度的影響酶促反應(yīng)的最適pHpH通過改變酶與底物分子解離狀態(tài)影響反應(yīng)速率最適pH不是酶的特征性常數(shù)，它受底物濃度、緩沖液種類與濃度、及酶純度等因素的影響。pH對某些酶活性的影響3.底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響當?shù)孜餄舛容^低時,V隨[S]的增大而急劇上升,兩者成正比關(guān)系。隨著底物濃度繼續(xù)增加,反應(yīng)速度增加,而幅度不斷下降。若繼續(xù)加大[S]，反應(yīng)速度就不再增加,達到一個極限值Vmax。底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響[S]與V的關(guān)系：米-曼氏方程

Vmax為最大反應(yīng)速度，Km為米氏常數(shù)，[S]為底物濃度當[S]Km時，，反應(yīng)速率與底物濃

度成正比當[S]Km時，VVmax，反應(yīng)達到最大速率Km與Vmax的意義1.Km值定義：Km等于酶促反應(yīng)速度為最大速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。意義：a)Km可表示酶與底物的親和力

b)同一種酶對于不同底物有不同的Km值c)Km是酶的特征性常數(shù)，只與酶的結(jié)構(gòu)、底物和反應(yīng)環(huán)境（溫度、pH、離子強度）有關(guān)，與酶濃度無關(guān)2.Vmax值：是酶完全被底物飽和時的反應(yīng)速度，與酶濃度成正比。Km和Vmax值的測定雙倒數(shù)作圖法：將米氏方程式兩側(cè)取雙倒數(shù)，得以1/V對1/[S]作圖，得出一直線。雙倒數(shù)作圖法4.抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響酶的抑制劑：凡能使酶的催化活性下降而不引

起酶蛋白變性的物質(zhì)。抑制作用種類可逆性不可逆性競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制競爭性抑制曲線圖

競爭性抑制劑與酶的底物結(jié)構(gòu)相似,與底物競爭酶的活性中心,從而阻礙酶與底物結(jié)合成中間產(chǎn)物。特點：（1）V下降，發(fā)生抑制（2）Vmax不變（3）Km增大，親和力下降非競爭性抑制曲線圖

抑制劑與酶活性中心以外的必需基團結(jié)合,不影響酶與底物的結(jié)合,底物與抑制劑之間沒有競爭關(guān)系。但酶-底物-抑制劑復(fù)合物不能進一步釋放出產(chǎn)物。特點：（1）V下降，發(fā)生抑制（2）Vmax減?。?）Km不變反競爭性抑制曲線圖特點:(1)V下降，發(fā)生抑制(2)Vmax減小(3)Km減小抑制劑與酶和底物形成的中間產(chǎn)物結(jié)合，使中間產(chǎn)物的量下降。既減少從中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的量，也同時減少從中間產(chǎn)物解離出游離酶和底物的量。競爭性抑制作用

競爭性抑制劑與酶的底物結(jié)構(gòu)相似，與底物競爭酶的活性中心，阻礙酶與底物形成中間產(chǎn)物，從而抑制酶的活性。競爭性抑制作用米氏方程雙倒數(shù)方程競爭性抑制作用特點：抑制劑與底物結(jié)構(gòu)相似兩者都與酶的活性中心結(jié)合抑制程度取決于抑制劑與酶的相對親和力及抑制劑與底物濃度的相對比例，增加底物濃度可減低或解除抑制作用動力學(xué)變化：Vmax不變、Km值變大

5.酶活性的測定

酶活性：是指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力，衡量標準是酶促反應(yīng)速度的大小。

酶促反應(yīng)的速度（V）：通常用單位時間，底物的消耗量或產(chǎn)物的生成量來表示，而一般測定時都是以產(chǎn)物的生成量為準。

磷酸苯二鈉法測定ALP的活性本次實驗以磷酸苯二鈉為底物，堿性磷酸酶(ALP)為催化劑，磷酸氫二鈉作為抑制劑，分別觀察觀察溫度、pH、底物濃度、抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響。C6H5NH3C-NH3C-CC-NH2C=O

H3C-NOH+

C6H5NH3C-NH3C-CC-N=

C=O

H3C-NOK3Fe(CN)6OH-4-氨基安替比林醌衍生物O-P=OONaONa磷酸苯二鈉+

H2O

ALPOHHO-P=OONaONa+

磷酸氫二鈉醌衍生物為紅色,根據(jù)紅色深淺測出光密度值,計算不同底物濃度時酶的反應(yīng)速度（以產(chǎn)物的生成量表示）。酚Lambert-Beer定律：=ＫＣＬ

Ａ100mL酶液在37℃下保溫15min產(chǎn)生1mg酚為一個酶活性單位。從標準曲線查出釋放出的酚量（μg）則可計算出酶活性三、試劑和儀器pH8.0、9.0、10、11.5甘氨酸緩沖液、0.04mol/L底物10mmol/L底物4-氨基安替比林0.5%鐵氰化鉀酶液0.5mol/LNaOHpH8.8Tris緩沖液、0.1mol/LpH10碳酸緩沖液磷酸氫二鈉蒸餾水四、操作步驟1.溫度對酶促反應(yīng)速度的影響2.pH對酶促反應(yīng)速度的影響3.底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響4.抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響五、結(jié)果與計算

酶活性的計算：在37℃下保溫15min產(chǎn)生1mg酚為一個酶活性單位，從標準曲線查出釋放出的酚量（μg）則可計算出酶活性。100ml酶活性=釋放出的酚量（μg）×1/0.1

×100×1/1000

=釋放出的酚量（mg）六、結(jié)果繪圖1、繪出pH對反應(yīng)速度的影響，標出最適pH。2、繪出溫度（T）對反應(yīng)速度的影響，標出最適溫度。3、繪出1/[S]對1/[V]的直線圖，求出Km和Vmax。4、繪出有抑制劑Na2HPO4時1/[S]對1/[V]的直線圖，求出有競爭性抑制劑存在時Km和Vmax的變化。[作圖]1/[S]1/V-1/Km

根據(jù)圖求得Km和Vmax,求出有競爭性抑制劑存在時Km和Vmax的