免疫學(xué)檢驗中的酶免疫技術(shù)

免疫學(xué)檢驗中的酶免疫技術(shù)20世紀(jì)中期，以放射免疫技術(shù)為代表的標(biāo)記免疫技術(shù)相繼問世，它將某種可微量或超微量測定的物質(zhì)（如放射性核素、熒光素、酶、化學(xué)發(fā)光劑等）標(biāo)記于抗原（抗體）上制成標(biāo)記物，加入到抗原抗體的反應(yīng)體系中與相應(yīng)的抗體（抗原）反應(yīng)，以檢測標(biāo)記物的有無及含量間接反映被測物的存在與多少。這些將標(biāo)記技術(shù)與抗原抗體反應(yīng)結(jié)合起來的免疫學(xué)檢測技術(shù)以其敏感性高、準(zhǔn)確性好、操作簡便、易于商品化和自動化等特點逐漸替代了凝集、沉淀等經(jīng)典的免疫學(xué)檢驗技術(shù)，不僅用于抗原、抗體、補體、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子等免疫相關(guān)物質(zhì)的檢測，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等體液中各種微量物質(zhì)的檢查，可以說一切具有抗原性或半抗原性的物質(zhì)原則上均可利用現(xiàn)代免疫檢驗技術(shù)進行檢測，使免疫學(xué)檢驗滲透到醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域。目前，免疫學(xué)檢驗中的標(biāo)記技術(shù)主要包括酶免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)、金免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)等。其中酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物反應(yīng)的高效性和專一性結(jié)合起來的一種免疫檢測技術(shù)。作為經(jīng)典的三大標(biāo)記技術(shù)之一，酶免疫技術(shù)在檢驗醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用并不斷得到更新。一、常用的酶及顯色底物在酶免疫技術(shù)中用于標(biāo)記的酶應(yīng)具有催化活性高、催化專一性強；與抗原抗體偶聯(lián)后不影響抗原抗體的免疫反應(yīng)性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物產(chǎn)生的信號產(chǎn)物易于觀察和檢測；對人無害且價廉、易得等特點，目前常用的酶及底物見表1。表1常用酶及底物常用酶底物加終止液前顏色加終止液后顏色辣根過氧化物酶（HRP）鄰苯二胺（OPD）橙黃色棕黃色RZ>3.1四甲基聯(lián)苯胺（TMB）藍(lán)色黃色堿性磷酸酶（AP）對硝基苯磷酸酯黃色黃色(p-NPP)二、標(biāo)記物的制備在酶免疫技術(shù)中制備標(biāo)記物的抗原應(yīng)純度高、抗原性完整；制備標(biāo)記物的抗體應(yīng)特異性好、效價高、親和力強、比活性高、能批量生產(chǎn)和易于分離純化。制備酶標(biāo)記物的方法應(yīng)符合簡單、產(chǎn)量高；避免酶、抗體（抗原）、酶標(biāo)記物各自形成聚合物；標(biāo)記反應(yīng)不影響酶的活性和抗原抗體的免疫反應(yīng)性等原則。標(biāo)記物制備的方法基本屬于兩類：（一） 交聯(lián)法交聯(lián)法是以一可同時與酶和抗體（抗原）結(jié)合的交聯(lián)劑作為“橋”，分別連接酶與抗體（抗原）的方法，此類方法中目前最常用的是戊二醛交聯(lián)法，形成的結(jié)合物為：酶-戊二醛-抗體（抗原）（二） 直接法直接法是用一活化劑首先將酶活化，被活化的酶分子上的基團直接可與抗體

（抗原）結(jié)合形成標(biāo)記物，如過碘酸鈉法。形成的結(jié)合物為：酶-抗體（抗原）。三、酶免疫技術(shù)類型

酶免疫技術(shù)按照抗原抗體系統(tǒng)是定位于組織細(xì)胞上還是存在于液體樣品中分為酶免疫組化技術(shù)和酶免疫測定（EIA），酶免疫測定又可分為均相酶免疫測定和異相酶免疫測定。（一）均相酶免疫測定均相酶免疫測定是利用酶標(biāo)記物結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物后，標(biāo)記酶的活性就受到抑制，因而反應(yīng)后不需分離結(jié)合的和游離的酶標(biāo)記物，直接測定系統(tǒng)中的總標(biāo)記酶的活性的變化，即可確定結(jié)合的酶標(biāo)記物的數(shù)量，從而得到待測物的含量的一種技術(shù)。常用于半抗原或小分子抗原如藥物、激素、毒品、興奮劑等的測定。常用的技術(shù)類型有：1.酶免疫增強測定技術(shù)（EMIT）:酶免疫測定增強技術(shù)中酶活性的抑制是由于標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合后空間位阻了酶與底物結(jié)合的部位而造成的。反應(yīng)模式常用競爭法，即當(dāng)未標(biāo)記抗原多，競爭性的與抗體結(jié)合多，則標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合少，酶的活性受到抑制少，酶活性高。因此，最終測得的酶活性與未標(biāo)記物的含量呈正相關(guān)。見圖1。ItMilWUW含量呈正相關(guān)。見圖1。ItMilWUW&二L卻網(wǎng)釦低1■出炕1* 菲記啟康星轉(zhuǎn)就壺?『帶虐少.■炳性量材輛夕、（*?）未*■Id瑕規(guī)航悴童伶也t卅或滋,RF店性兩2.克隆酶供體免疫分析（CEDIA）：克隆酶供體免疫分析中酶是以供體和受體兩個片段存在的，只有兩個片段結(jié)合在一起形成全酶才能具有活性，當(dāng)標(biāo)記了供體酶的抗原與抗體結(jié)合后就空間位阻了酶供體（ED）與酶受體（EA）的結(jié)合,從而不能形成有活性的全酶，酶活性受到抑制。在反應(yīng)模式上同樣為競爭性結(jié)合分析方法，最終測得的酶活性與未標(biāo)記抗原的含量呈正相關(guān)。見圖2。（一）異相酶免疫測定異相酶免疫測定與均相酶免疫測定的最大區(qū)別是抗原抗體反應(yīng)平衡后，在反應(yīng)體系中同時存在著游離的和結(jié)合的兩種酶標(biāo)記物，兩種標(biāo)記物上的酶都具有酶活性，而只有結(jié)合的酶標(biāo)記物的形成與含量才代表待測物的存在與含量。因此，需將游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物分離，測定結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)物的活性推算待測物的含量。因分離游離和結(jié)合的標(biāo)記物的方法不同，異相酶免疫測定又分成液相酶免疫測定和固相酶免疫測定兩類方法。液相酶免疫測定，由于游離的和結(jié)合的標(biāo)記物都存在于液相中，故需用分離劑將二者分開后才能測定結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物的活性。而固相酶免疫測定，是通過載體將結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物吸附在固相支持物上，只需洗滌就可將游離的酶標(biāo)記物去除。目前固相酶免疫測定以酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）為最常用。綜上所述酶免疫技術(shù)的類型可歸納為：一、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（一）基本原理酶聯(lián)免疫吸附試驗的基本原理是將過量抗體（抗原）包被于載體上，通過抗原抗體反應(yīng)使酶標(biāo)記抗體（抗原）也結(jié)合在載體上，經(jīng)洗滌去除游離的酶標(biāo)記抗體（抗原）后，加入底物顯色，定性或定量分析有色產(chǎn)物確定待測物的存在與含量的檢測技術(shù)。（二）技術(shù)類型酶聯(lián)免疫吸附試驗的主要技術(shù)類型有雙抗體夾心法、間接法、競爭法、捕獲1．各種技術(shù)類型的原理如下：雙抗體夾心法用于檢測抗原。它是利用待測抗原上的兩個抗原決定簇A和B分別與固相載體上的抗體A和酶標(biāo)記抗體B結(jié)合，形成抗體A-待測抗原-酶標(biāo)抗體B復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測抗原含量成正比，屬非競爭性反應(yīng)類型。間接法用于測定抗體。它的原理是將已知抗原連接在固相載體上，待測抗體與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原-待測抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測抗體量成正比，屬非競爭性反應(yīng)類型。競爭法既可用于檢測抗原又可用于檢測抗體。它是用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測的非標(biāo)記抗原（抗體）競爭性的與固相載體上的限量抗體（抗原）結(jié)合，待測抗原（抗體）多，則形成非標(biāo)記復(fù)合物多，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就少，也就是酶標(biāo)記復(fù)合物少，因此，顯色程度與待測物含量成反比。捕獲法用于測定IgM類抗體。固相載體上連接的是IgM的二抗，先將標(biāo)本中的IgM類抗體捕獲，防止IgG類抗體對IgM測定的干擾，此步驟也是其稱為捕獲法的原因所在，然后再加入特異抗原和酶標(biāo)抗體，形成抗體IgM-IgM-特異抗原-酶標(biāo)抗體的復(fù)合物，復(fù)合物含量與待測IgM成正比，也屬非競爭性反應(yīng)類型。2.各種技術(shù)類型的主要區(qū)別：見表2。表2ELISA常用技術(shù)類型比較類型固相載體上的包被物待測物酶標(biāo)記物顯色程度與待測物含量間的關(guān)系雙抗體夾心法（步法）抗體A抗原酶標(biāo)抗體B正相關(guān)間接法抗原抗體酶標(biāo)二抗正相關(guān)競爭法抗原（抗體）抗體（抗原）酶標(biāo)抗體（抗原）負(fù)相關(guān)捕獲法抗IgMIgM酶標(biāo)抗體正相關(guān)三）技術(shù)要求1?常用的固相載體：ELISA中最常用的固相載體用聚苯乙烯制備，可制成微量反應(yīng)板、小試管和小株，現(xiàn)多用微量反應(yīng)板，它吸附性能好、空白值低、孔底透明度高、批間穩(wěn)定性好、價格低廉且易于與自動化儀器配套。另外，聚乙烯、聚氯乙烯酰胺等塑料制品也有使用。除塑料外，還可使用膜載體（如硝酸纖維素膜）、磁化微顆粒等。2．固相包被物的制備：固相包被物的制備方法可以是吸附或化學(xué)偶聯(lián)。用聚苯乙烯做載體包被抗原（抗體）常用吸附的方法。4°C過夜或37°C2?6h經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。為防止包被后載體上留有未包被的空隙而導(dǎo)致本底過高，常用1％?5％牛血清白蛋白封閉空隙。3．最佳工作濃度的選擇：在酶聯(lián)免疫吸附試驗中為防止本底高和靈敏度低，需要對包被抗體（抗原）和酶標(biāo)抗體（抗原或二抗）進行滴定和選擇最佳工作濃度。如夾心法最佳工作濃度的選擇是用棋盤滴定法同時選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度。如表三所示包被抗體選擇3個濃度酶標(biāo)抗體也選擇3個濃度分別與包被抗體的3個濃度配伍，然后分別加入強陽性抗原、弱陽性抗原和陰性對照，得到27個A值，以強陽性抗原A值在0.8,陰性對照A值＜0.1為最佳工作條件，按照表3的測定結(jié)果可知包被抗體的最佳工作濃度是1mg/L,酶標(biāo)抗體的工作濃度是1：5,000。表3雙抗體夾心法包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度選擇的棋盤法包被抗體的濃度酶標(biāo)抗體稀釋度強陽性抗原弱陽性抗原陰性對照10mg/L1:100081:50000.480.0401:250000.13001mg/L1:1000>20.260.101:50000.900.120.011:250000.240.0100.1mg/L1:10000.430.130.121:50000.110.040.021:250000.0300二、酶免疫技術(shù)的發(fā)展酶免疫測定具有高度敏感性、特異性，而且它的試劑比較穩(wěn)定，操作簡單且無放射性危害，特別是商品試劑盒和自動化儀器的應(yīng)用，使其成為一種適用于各級檢驗部門的免疫標(biāo)記技術(shù)。隨著檢驗醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，酶免疫測定的方法、技術(shù)也得到發(fā)展和更新，斑點-ELISA、發(fā)光酶免疫測定、免疫印跡法、BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法不斷得到應(yīng)用。（一） 斑點-ELISA斑點-ELISA的原理與ELISA的區(qū)別在于用對蛋白質(zhì)有極強吸附力的硝酸纖維素膜代替塑料制品作為固相載體，酶作用底物后在硝酸纖維素膜上形成有色沉淀而使膜著色。它的靈敏度較一般ELISA高6?8倍、可達(dá)ng水平，試劑用量小，不需其它設(shè)備條件。（二） 免疫印跡法免疫印跡法是將電泳與ELISA結(jié)合起來的一種方法。它先經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚苯烯酰胺凝膠電泳將樣品進行分離，通過轉(zhuǎn)印將被分離的各區(qū)帶原位轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后把印有蛋白質(zhì)條帶的膜當(dāng)成包被抗原的固相載體，做酶免疫測定。所以它的方法分為電泳、轉(zhuǎn)印、酶免疫測定三個階段。免疫印跡法結(jié)合了電泳的高分辨率和酶免疫測定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣品組分的免疫學(xué)測定方法。（三）發(fā)光酶免疫測定發(fā)光酶免疫測定與一般EIA的區(qū)別是酶所催化的底物是發(fā)光劑。產(chǎn)物不是一般EIA的有色物質(zhì)，而是發(fā)光產(chǎn)物，所發(fā)出的光可用特定的儀器測定。常用的酶是HRP和AP,HRP的發(fā)光底物有魯米諾及衍生物、對-羥基苯乙酸；AP的底物為3-（2-螺旋金剛烷）-4-甲氧基-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷和4-甲基傘形酮磷酸鹽。（四）BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗是將生物素-親和素（BAS）放大系統(tǒng)與ELISA結(jié)合起來的一種技術(shù)。生物素（B）是一種小分子的生長因子，有兩個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中一個可以和親和素結(jié)合,另一個可以和包括酶、抗原（抗體）的多種物質(zhì)結(jié)合。親和素（A）又稱卵白素，有4個亞基，都可與生物素穩(wěn)定結(jié)合，此為放大系統(tǒng)的關(guān)鍵，即有1個親和素就能結(jié)合4個生物素，親和素也可被酶標(biāo)記。在BAS的應(yīng)用中正是利用了生物素和親和素的這些特點，設(shè)計了兩類反應(yīng)類型：一類是以游離親和素為“橋”，分別連接生物素化抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)和酶標(biāo)生物素。此種類型有BAB法和ABC法，另一類是直接用標(biāo)記親和素連接生物素化抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)，此種類型有BA法。以雙抗體夾心法測抗原為例，各種類型的反應(yīng)式表示如下。BAB法的反應(yīng)式可表示為：固相抗體＋待測抗原＋抗體-生物素＋親和素＋生物素-酶＋底物。ABC法的反應(yīng)式可表示為：固相抗體+待測抗原+抗體-生物素+親和素+生物素-酶-底物。BA法的反應(yīng)式可表示為：固相抗體+待測抗原+抗體-生物素+親和素-酶+底物。這種通過BAS放大作用可將更多的酶聚集在固相載體上，使酶免疫技術(shù)檢測的靈敏度進一步得到提高。思考題1．關(guān)于酶免疫技術(shù)中所用的酶，下列哪項不正確：與抗原抗體偶聯(lián)后不影響抗原抗體的免疫反應(yīng)性和酶活性常用HRP和AP催化底物產(chǎn)生的信號產(chǎn)物易于觀察和檢測HRP的RZ<3.1AP的底物常用對硝基苯磷酸酯2.酶免疫技術(shù)中標(biāo)記物為制備的直接法常用戊二醛交聯(lián)法過碘酸鈉法攪拌法透析法氯胺T法3．酶免疫測定的方法可分成均相酶免疫測定和液相酶免疫測定異相酶免疫測定和液相酶免疫測定均相酶免疫測定和異相酶免疫測定固相酶免疫測定和異相酶免疫測定固相酶免疫測定和均相酶免疫測定關(guān)于均相酶免疫測定敘述中下列哪項不正確反應(yīng)后不需分離游離的和結(jié)合的標(biāo)記物常用于半抗原或小分子抗原的測定抗原抗體的反應(yīng)類型上常用競爭法EMIT中酶活性的抑制是由于抗原與抗體結(jié)合后空間位阻了酶與底物結(jié)合的部位而造成的CEDIA中標(biāo)記在抗原（抗體）上的酶具有酶活性用于檢測IgM類抗體的ELISA技術(shù)類型是雙抗體夾心法間接法競爭法捕獲法以上都不是關(guān)于ELISA競爭法正確的是只用于檢測抗原只用于檢測抗體酶標(biāo)記物與未標(biāo)記物的免疫性不同待測物多則顯色淺陰性對照管中形成的酶標(biāo)記復(fù)合物最少ELISA中最常用于固相載體的是聚乙烯聚苯乙烯聚氯乙烯酰胺硝酸纖維素膜磁化微顆粒雙抗體夾心法最佳工作濃度的選擇用棋盤滴定法抗原稀釋法抗體稀釋法酶標(biāo)抗體稀釋法抗原抗體稀釋法發(fā)光酶免疫測定中HRP最常用的底物是鄰苯二胺四甲基聯(lián)苯胺魯米諾及衍生物對硝基苯磷酸酯以上都不是在下述技術(shù)中屬于膜載體酶