非小細胞肺癌患者EGFR基因檢測

NSCLC患者EGFR基因突變檢測腺癌的驅(qū)動基因LCMC(美國)MSN(法國)中國日本EGFR17%13%40%50%KRAS22%28%7%15%ELM4-ALK7%2%7%5%BRAF2%2%2%1%HER21%1%NA3%PIK3CA1%1%4%NAPTENNANA6%NAMET擴增1%1%5%4%Nil46%33%29%22%KrisASCO2011PlanchardELCC2012WuJSMO2011MitsudomiJCCO2010

97%的基因突變互相排斥單個突變數(shù)ALKAKTBRAFEGFRHER2KRASMEK1METNRASPIK3CAALK(38)X1211AKT(1)XBRAF(9)X1EGFR(89)X13HER2(3)XKRAS(114)X11MEK1(2)X11METAMP(3)XNRAS(2)XPIK3CA(6)XKrisMG.etal.ASCO2011,Abstract#CRA7506.

4高加索人腺癌各基因構(gòu)成比圖5中國人肺腺癌各基因構(gòu)成比圖關(guān)于“驅(qū)動基因”近50%NSCLC驅(qū)動基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)雙基因同時突變罕見對已知的靶點，已有很多上市或在研的藥物驅(qū)動基因突變狀態(tài)與人種、性別、病理類型、吸煙狀況等有關(guān)，不同類型用藥不同。NSCLC基因檢測的意義基因檢測決定了分子靶向治療2011年我國制定了:中國非小細胞肺癌患者表皮生長因子受體基因突變檢測專家共識EGFR基因突變檢測的臨床意義EGFR-TKI一線治療必須進行EGFR基因突變的檢測，國內(nèi)外均推薦EGFR基因突變陽性的NSCLC給予EGFR-TKI一線治療優(yōu)勢人群不代表個體：盡管在女性、亞裔、不吸煙或少吸煙、腺癌EGFR基因突變發(fā)生頻率較高，但在鱗癌、腺鱗癌，甚至SCLC中也可檢測到EGFR基因突變。EGFR基因突變檢測的臨床意義EGFR突變不同類型療效也不一樣，19-del較L858R療效好,檢測的必要性EGFR基因突變檢測的臨床意義化療能改變EGFR突變狀態(tài)264例一線化療的Шb~IV期NSCLC患者的血DNA標(biāo)本，EGFR突變率在化療后顯著降低（23.1%對34.5%，P<0.001）提示檢測更有必要，決定TKI一線治療的時機全國檢測情況(基康+迪安)國內(nèi)EGFR基因突變率在我國未經(jīng)選擇的NSCLC中EGFR突變約30%，腺癌突變約42.5%，非腺癌約9.5%。2012年基康公司共收到1500名患者樣品，全部完成檢測，其中108名患者的樣品因DNA質(zhì)量不合格而終止檢測，因此共有1392名患者已出檢測結(jié)果，其中660名患者突變陽性（47%），其中腺癌、腺鱗癌、BAC為52%，鱗癌為14%。國內(nèi)EGFR基因突變率銅陵檢測結(jié)果（ARMS法）送檢66份標(biāo)本,11份無結(jié)果，55份有結(jié)果，檢出率83.33%，不同標(biāo)本檢出率n有結(jié)果檢出率手術(shù)3030100%淋巴結(jié)活檢66100%氣管鏡13538.5%肺穿11872.7%胸腔鏡11100%胸水55100%合計665583.33%EGFR突變率55份有結(jié)果的標(biāo)本中，29份EGFR突變陽性，突變率55.7%EGFR突變類型n檢出率L858R1448.3%19-del1137.9%L858R+19-del310.3%G719X14.2%合計293.5%EGFR突變與病理類型突變率腺癌男44.4%(8/18)女68%(17/25)腺鱗癌男33.33%(1/3)女100%（1/1）鱗癌男14.3%(1/7)女50%(1/2)合計55.7%(24/42)EGFR基因突變檢測的一般原則為使患者盡可能地從最有效的治療中受益，所有NSCLC，只要條件許可，都應(yīng)進行EGFR突變的檢測，特別是肺腺癌。EGFR基因突變檢測標(biāo)本腫瘤部位的新鮮組織、活檢組織、手術(shù)切除標(biāo)本和細胞學(xué)標(biāo)本均可用于EGFR突變的檢測。理想的標(biāo)本，需保證200～400個腫瘤細胞（文獻報道大于100個即可）檢測標(biāo)本冰凍組織外科手術(shù)標(biāo)本：最好標(biāo)本，可獲得高質(zhì)量腫瘤DNA，取得可靠檢測結(jié)果---廣泛使用穿刺活檢、支氣管鏡標(biāo)本：量少，但腫瘤DNA質(zhì)量仍好，獲得較可靠檢測結(jié)果---使用受限檢測標(biāo)本固定包埋組織外科手術(shù)標(biāo)本：可得足量腫瘤DNA，雖然DNA片段化，但仍獲得可靠檢測結(jié)果---使用受限支氣管鏡、穿刺活檢標(biāo)本：可得腫瘤DNA量少且片段化，獲得較可靠檢測結(jié)果，有時DNA量少。---極度受限檢測標(biāo)本淋巴結(jié)標(biāo)本也可——淋巴結(jié)標(biāo)本中EGFR突變能否反映原發(fā)灶中EGFR狀態(tài)？外周血、癌性胸水、經(jīng)支氣管細針穿刺標(biāo)本有研究也有陽性結(jié)果外周血標(biāo)本：血漿中游離DNA（cfDNA）濃度變化很大（10~1200ng/ml）,cfDNA片段很短（180bp），可能多由凋亡產(chǎn)生，腫瘤釋放的cfDNA在總cfDNA中的含量不穩(wěn)定（3%~93%）胸水可以做——前景很好標(biāo)本的處理新鮮組織（手術(shù)、穿刺、支纖鏡下活檢樣本等）含有腫瘤組織50%以上；重量≥10ｍg（約米粒大小，盡量提供所有穿刺樣本），經(jīng)PBS或生理鹽水沖洗干凈。取癌組織的中心位置組織塊，切至厚度在0.5cm以下，浸沒于75～100%的乙醇中60分鐘以上；可在4℃冰箱暫時保存。送檢前可倒掉試管內(nèi)的乙醇，倒入所提供的標(biāo)準試管，擰緊蓋子，常溫運輸，確保樣本在3天內(nèi)到達。標(biāo)本的處理癌性胸水脫落細胞盡量收集更多胸水，離心后去掉上清，沉淀物必須>1毫升。如需長途運輸，加入乙醇浸泡60分鐘以上。為符合托運要求，可付運前可離心后倒掉試管內(nèi)的乙醇，倒入所提供的標(biāo)準試管，擰緊蓋子，常溫運輸，確保3天內(nèi)到達。EGFR檢測方法目前公認有兩種：測序法和ARMS法（等位基因特異PCR+熒光探針）EGFR檢測方法測序法ARMS法敏感度10~30%(變異)1~0.1%(變異)發(fā)現(xiàn)突變已知和未知已知石蠟包埋組織成功率低高假陽性（交叉污染）多少假陰性多少檢測流程復(fù)雜漫長，污染多簡單快速儀器成本高低試劑成本低略高EGFR檢測方法北京協(xié)和張靜報道：82例NSCLC直接測序法中24例無結(jié)果，ARMS法均有結(jié)果，且16例檢測到變異中華病理學(xué)雜志，2008,37（5）有結(jié)果變異率測序法70.7%（58/82例）43.1%(25/58例）ARMS法100%（82/82例）51.2%(42/82例）

關(guān)于胸水EGFR突變的檢測CancerSci.2006;97(7):642-8.IntJCancer.2006;119(10):2353-8.ChangGungMedJ.2006;29(4):373-9.BrJCancer.2006;95(10):1390-5.JCancerResClinOncol.2010;136(9):1341-7.國內(nèi)外胸水標(biāo)本EGFR檢測的研究作者國家/地區(qū)病例數(shù)EGFR突變率（%）KimuraH日本2433%SohJ日本6126%HungMS臺灣2941%KimuraH日本4325.6%JianG中國3228.1%用胸水檢測腫瘤EGFR突變需要敏感方法用胸水中細胞及無細胞液均可檢測EGFR突變，且檢出率基本相同目前缺少胸水與腫瘤組織直接對比（配對樣本檢測）數(shù)據(jù)，故對其敏感度與特異性尚無結(jié)論胸膜轉(zhuǎn)移和胸水的對比研究本研究的目的：探索胸腔積液與胸膜轉(zhuǎn)移灶EGFR突變檢測的一致性，從而判斷當(dāng)存在胸膜轉(zhuǎn)移灶時，胸液EGFR基因突變狀態(tài)檢測的價值。收集2011年4月-2012年12月間就診于上海長海醫(yī)院呼吸科符合入組條件患者的胸液標(biāo)本及相應(yīng)的胸膜轉(zhuǎn)移病灶組織，共35對樣本。研究步驟胸膜轉(zhuǎn)移灶樣本采集電子胸腔鏡在局麻下進行胸腔鏡檢查術(shù)鏡下見病灶后以活檢4-6塊組織，10%中性福爾馬林固定，后包埋成蠟塊每例蠟塊切取10-12片5μm厚連續(xù)切片，切片在37℃烘箱內(nèi)烤片3h后常溫保存研究步驟胸腔積液樣本采集每例患者同時收集胸水100-200ml，常溫靜置30min后取上清15ml，-80℃保存，為待檢測的胸液上清；在去除上清液后，將剩余沉淀物室溫1000g轉(zhuǎn)速離心10min，包裹細胞沉淀，常規(guī)固定、包埋并切片（具體同胸膜轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本），為待檢測的胸液沉淀；每例蠟塊切取10-12片5μm厚連續(xù)切片，切片在37℃烘箱內(nèi)烤片3h后常溫保存。胸膜活檢組織EGFR突變狀況病人數(shù)EGFR突變突變率%P男性18633.30.094女性171164.7有吸煙史101100.007無吸煙史251664胸液沉淀與相應(yīng)胸膜轉(zhuǎn)移灶EGFR突變的比較

胸膜組織EGFR突變胸液沉淀EGFR突變+-合計+12416-2810合計141226符合率為73.1%胸液上清與相應(yīng)胸膜轉(zhuǎn)移灶EGFR突變的比較胸膜組織EGFR突變胸液上清EGFR突變+-合計+14216-31619合計171835符合率為85.7%胸液上清與相應(yīng)沉淀EGFR突變的比較胸液沉淀EGFR突變胸液上清EGFR突變+-合計+12113-4913合計161026符合率為80.8%胸液EGFR突變檢測率的比較敏感性特異性例數(shù)比百分數(shù)例數(shù)比百分數(shù)胸液沉淀12/1485.7%8/1266.7%胸液上清14/1782.4%16/18