蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)四、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)G250法，紫外吸收法一、基本原理

利用某些物質(zhì)的分子吸收紫外光、可見(jiàn)光、紅外光和激光200~800nm光譜區(qū)的輻射來(lái)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析測(cè)定的方法。稱(chēng)為分光光度法或分光光度技術(shù)，使用的儀器稱(chēng)為分光光度計(jì)。這種分光光度計(jì)靈敏度高，測(cè)定速度快，應(yīng)用范圍廣，其中的紫外/可見(jiàn)分光光度技術(shù)更是生物化學(xué)研究工作中必不可少的基本手段之一。紫外區(qū)可分為紫外（近紫外）和真空紫外（遠(yuǎn)紫外）。由于吸收池（又稱(chēng)樣品池、比色杯等）和光學(xué)元件以及氧氣能吸收小于190nm波長(zhǎng)的光，因此常規(guī)紫外測(cè)定集中在近紫外區(qū)，即200nm-400nm。可見(jiàn)光區(qū)為400nm-800nm。

測(cè)定某物質(zhì)的紫外吸收光譜的曲線，可與已知標(biāo)準(zhǔn)的紫外光譜圖相對(duì)照，對(duì)照時(shí)須注意測(cè)定的條件，如溶劑、濃度等。常用標(biāo)準(zhǔn)的紫處吸收光譜是薩德勒研究實(shí)驗(yàn)公司編制的“Sadtler”紫外標(biāo)準(zhǔn)圖譜集，到七十年代末為止已收集28585個(gè)化合物紫外光譜圖，此外還有藥物和非極性溶劑紫外光譜圖2000多幅。由于化合物紫外吸收峰較少，而且峰形都很寬，不象紅外光譜是許多指紋峰，所以在用紫外吸收光譜進(jìn)行化合物定性鑒定時(shí)，應(yīng)注意：化合物相同，其紫外光譜應(yīng)完全相同；但是紫外光譜相同不一定化合物就相同，可能僅是存在某些相同的發(fā)色團(tuán)或基團(tuán)，因此在鑒定時(shí)應(yīng)與紅外光譜相結(jié)合。

Beer-Lambert定律朗伯-比爾光吸收定律：

A＝－lgT＝εbc

A：吸光度，又稱(chēng)光密度“O.D”。T：透光度，T＝I/I。（I。為照射到吸收池上的光強(qiáng)，I為透過(guò)吸收池的光強(qiáng)）ε：摩爾吸光系數(shù)或克分子吸光系數(shù)（L·mol－1·cm－1）。b：樣品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收地，b=1cm。c：樣品濃度（mol/L）。

由上式可以看出：吸光度A與物質(zhì)的吸光系數(shù)“ε”和物質(zhì)的濃度“C”成正比。摩爾吸光系數(shù)：，是物質(zhì)對(duì)某波長(zhǎng)的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光的能力越強(qiáng)，相應(yīng)的分光度法測(cè)定的靈敏度就越高。ε值越大，說(shuō)明電子躍遷的幾率大，通常ε＝10-105：一般認(rèn)為ε＞104為強(qiáng)吸收；ε＝103-104

為較強(qiáng)吸收；ε＜102

為弱吸收，此時(shí)分光光度法不靈敏。因?yàn)橥ǔＪ褂梅止夤舛扔?jì)可檢測(cè)出的最小吸光度A＝0.001,所以，當(dāng)b＝1cm,ε＝105時(shí)，可檢測(cè)的溶液最小濃度是C＝10-8mol/L。吸光度“A”有一個(gè)重要性質(zhì)是其具有加和性：即混合物的總吸光度等于溶液中的各組份各自在該波長(zhǎng)下吸光度的算術(shù)和。這是多元混合物分光光度法定量分析的基礎(chǔ)。若溶液中各溶質(zhì)的吸光系數(shù)ε相同，則各溶質(zhì)吸光度的大小與溶質(zhì)濃度成比例。例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池測(cè)定260nm處的吸光度為0.650，用同一吸收池測(cè)定純?nèi)軇┑奈舛葹?.070，計(jì)算尿嘧啶溶液的摩爾濃度，已知其摩爾吸光系數(shù)=8.2×103

M－1cm－1（M＝mol/L）?！逜＝εbC∵A＝（溶劑加樣品的吸光度）－（溶劑的吸光度）∴A＝0.650－0.070＝0.580∵b＝1cm∴C==7.1×10－5mol/L3.影響吸光系數(shù)的因素ε的大小取決于物質(zhì)的本性和光的波長(zhǎng)化學(xué)因素：溶液中溶質(zhì)可因濃度改變而有離解、締合與溶劑間的作用等等原因而發(fā)生偏離Beer定律的現(xiàn)象。化學(xué)因素引起的偏離，有時(shí)可控制溶液濃度設(shè)法減免。比如在強(qiáng)酸性溶液中滴定鉻酸溶液就可以避免偏離現(xiàn)象。光學(xué)因素：非單色光、雜散光、散射光、反射光以及非平行光等都會(huì)造成偏離現(xiàn)象?？捡R斯亮藍(lán)G250法原理：考馬斯亮藍(lán)G250與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其最大吸收波長(zhǎng)從465nm改變?yōu)?95nm,該蛋白－染料復(fù)合物吸光系數(shù)很高，所以檢測(cè)靈敏度很高，可以測(cè)定1μg/mL的蛋白質(zhì)，染料和蛋白結(jié)合只需要2分鐘，顏色在1小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。操作簡(jiǎn)便，快速，是常用的蛋白含量測(cè)定方法之一。去污劑，粘多糖等嚴(yán)重干擾該方法的測(cè)定試劑:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（0.5mg/ml）考馬斯亮藍(lán)G250蛋白染色劑操作步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取8只試管，分別加入0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足體積至3mL,然后加入5ml考馬斯亮藍(lán)試劑，震蕩混勻，2分鐘后于595nm測(cè)定吸光值，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定：樣品液1mL,用水補(bǔ)足體積至3mL,然后加入5ml考馬斯亮藍(lán)試劑，

595nm測(cè)定吸光值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的濃度。計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量紫外吸收法測(cè)定核酸蛋白質(zhì)的含量原理：蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，在280nm處有吸收峰。其吸收值與含量成正比關(guān)系。可用作定量測(cè)定。紫外吸收光譜主要是由于雙鍵電子，尤其是共軛雙鍵中的π電子和未共享的電子對(duì)的激發(fā)所產(chǎn)生的。所以各種物質(zhì)分子對(duì)紫外光的吸光性質(zhì)取決于該分子的雙鍵數(shù)目和未共享電子對(duì)的共軛情況等。蛋白質(zhì)濃度（mg/mL)=1.45A280-0.74A260；DNA濃度（μg/mL)＝A260×稀釋倍數(shù)／（0.024×L）試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（1mg/ml)操作步驟取兩只小試管，甲管加入1.5mL

樣品（蛋白質(zhì)或核酸）1.5mL蒸餾水，乙管加入3mL蒸餾水，(注意：此實(shí)驗(yàn)與書(shū)上步驟不同，直接測(cè)試按公式計(jì)算即可)

測(cè)定樣品在28