色譜分析法導(dǎo)論

色譜分析法導(dǎo)論一、色譜分析概論問題問題1：什么是色譜法？問題2：為什么色譜法能將混合物分開？問題3：色譜法的分類？問題4：各種色譜法的應(yīng)用范圍？1、什么是色譜法？茨維特的實(shí)驗(yàn)茨維特：俄國(guó)植物學(xué)家，主要從事植物色素的研究工作，在1906

年發(fā)表的文章中，首次提出了色譜的概念。茨維特的實(shí)驗(yàn)因此色譜法是一種分離方法。它的特點(diǎn)是：有兩相，一是固定相，一是流動(dòng)相，兩相作相向運(yùn)動(dòng)。Chromatography將色譜法用于分析中，則稱為色譜分析。色譜分析是一種分離、分析法。2、色譜法分離原理當(dāng)流動(dòng)相中所攜帶的混合物流過固定相時(shí)，就會(huì)和固定相發(fā)生作用(力的作用)。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上有差異，與固定相發(fā)生作用的大小也有差異。因此在同一推動(dòng)力作用下，不同組分在固定相中的滯留時(shí)間有長(zhǎng)有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出。3、色譜法的分類

按流動(dòng)相狀態(tài)的不同，可分為氣相色譜法(GC)液相色譜法(LC)超臨界流體色譜(SFC)什么是氣相色譜法？以氣體為流動(dòng)相的色譜法GasChromatogaphy，簡(jiǎn)稱GC按固定相狀態(tài)的不同可分為：氣固色譜(GSC)氣液色譜(GLC)適合分離分析易汽化（在-190℃-500℃范圍內(nèi)有的蒸氣壓的）穩(wěn)定、不易分解、不易反應(yīng)的樣品，特別適合用于同系物、同分異構(gòu)體的分離。什么是液相色譜法？以液體為流動(dòng)相的色譜法LiquidChromatogaphy，簡(jiǎn)稱LC適合分離分析高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、離子型的樣品。應(yīng)用舉例(HPLC)按固定相使用的形式可分為柱色譜（ColumnChromatography）將固定相裝在色譜柱內(nèi)紙色譜（PaperChromatography）用濾紙做固定相或固定相載體的色譜薄層色譜（ThinLayChromatography）固定相均勻涂在玻璃板或塑料板上

關(guān)于分配平衡分配系數(shù)K(distributioncoefficient)分配比k又稱為容量因子、容量比、分配容量，是指在一定溫度和壓力下，平衡狀態(tài)時(shí)組分在固定相中的量與在流動(dòng)相中的量之比值。是衡量柱子對(duì)組分保留能力的重要參數(shù)。相比β

色譜柱內(nèi)固定相和流動(dòng)相體積之比

是柱型及結(jié)構(gòu)的重要特征。

4.色譜相關(guān)術(shù)語關(guān)于色譜峰關(guān)于保留值關(guān)于分配平衡

關(guān)于色譜峰的術(shù)語峰峰高基線峰寬半峰寬峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差σ

色譜峰寬（區(qū)域?qū)挾龋┓宓讓扺b

在色譜峰兩邊的轉(zhuǎn)折點(diǎn)所畫的切線與基線相交的截距。標(biāo)準(zhǔn)偏差σ拐點(diǎn)間距離的一半

半峰寬度峰高一半處的峰寬度

W

1/2=2.354σ

峰底寬

Wb=4σ

拐點(diǎn)處峰寬

Wσ=2σ

（4）色譜圖的信息

a.色譜峰個(gè)數(shù)判斷試樣中所含組分的最少數(shù)

b.色譜保留值定性

c.色譜峰面積或峰高定量A=KCd.保留值與區(qū)域?qū)挾仍u(píng)價(jià)柱分離效能依據(jù)

e.兩峰間距評(píng)價(jià)兩組分能否分離

關(guān)于保留值的術(shù)語死時(shí)間(tM):無保留組分出峰時(shí)間保留時(shí)間(tR):從進(jìn)樣開始到色譜峰最大值出現(xiàn)所需時(shí)間調(diào)整保留時(shí)間(t’R):死體積(VM):保留體積(VR):

調(diào)整保留體積(V’R):相對(duì)保留值ɑ：二、色譜分析法基本理論研究理論的目的解決色譜峰的分離問題三個(gè)色譜基本理論問題色譜熱力學(xué)問題——發(fā)展高選擇性色譜柱色譜動(dòng)力學(xué)問題——發(fā)展高效能色譜柱分離條件的最優(yōu)化問題——分離條件優(yōu)化1、色譜動(dòng)力學(xué)理論

研究流出曲線展寬的本質(zhì)及曲線形狀變化的影響因素塔板理論速率理論（1）塔板理論推導(dǎo)

塔板理論將色譜柱比作精餾塔，通過概率理論得到流出曲線方程：為標(biāo)準(zhǔn)偏差當(dāng)t=tR時(shí)，C=Cmax，峰高正比于進(jìn)樣量C0，是峰高定量的理論基礎(chǔ)。當(dāng)n越大，柱效越大，Cmax/C0越大。即保留時(shí)間一定時(shí)，塔板數(shù)越多，峰越高。Cmax反比于tR，tR小，Cmax大，保留時(shí)間小的組分峰高且窄。tR大，Cmax小，保留時(shí)間大的組分峰低且寬。

對(duì)色譜流出曲線方程的討論

柱效

由流出曲線方程導(dǎo)出：

H=L/nn是峰相對(duì)展寬的量度n是柱效的量度n是常數(shù)時(shí)，W與tR

成正比n越大，H越小，表明組分在柱中達(dá)到的分配平衡次數(shù)越多，對(duì)分離越有利，但還不能預(yù)言各組分有被分離的可能性。

塔板理論的貢獻(xiàn)塔板理論有助于我們形象的理解色譜的分離過程。導(dǎo)出色譜流出曲線方程，它符合高斯分布，與實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象相吻合。導(dǎo)出理論塔板數(shù)的計(jì)算公式，作為柱效的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

塔板理論的局限塔板高度H是一個(gè)抽象的物理量，它的色譜本質(zhì)是什么？它與哪些參變量有關(guān)，又怎樣影響峰的擴(kuò)張？對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)意義有限。不能解釋流速對(duì)理論塔板數(shù)的影響。有些假設(shè)不合理，如沒有考慮縱向擴(kuò)散對(duì)色譜分離的影響等。（2）速率理論概述速率理論是1956年荷蘭學(xué)者VanDeemter等提出，因此又稱作范第姆特方程。運(yùn)用流體分子規(guī)律研究色譜過程中產(chǎn)生色譜峰擴(kuò)展的因素，導(dǎo)出了理論塔板高度與流動(dòng)相線速度的關(guān)系，揭示了影響塔板高度的動(dòng)力學(xué)因素。

氣相色譜中速率方程的導(dǎo)出速率理論討論的是色譜峰展寬原因，即影響塔板數(shù)n的因素，也就是影響塔板高度H的因素。H=A+B/u+Cu渦流擴(kuò)散項(xiàng)A=2λdp渦流擴(kuò)散項(xiàng)均勻性因子粒徑

渦流擴(kuò)散項(xiàng)A

由不等路徑造成的色譜峰擴(kuò)展。由于柱填料粒徑大小不同，粒度分布范圍不一致及填充的不均勻，形成寬窄、長(zhǎng)短不同的路徑，因此流動(dòng)相沿柱內(nèi)各路徑形成紊亂的渦流運(yùn)動(dòng)，有些溶質(zhì)分子沿較窄且直的路徑運(yùn)行，以較快的速度通過色譜柱，發(fā)生分子超前，反之，有些分子發(fā)生滯后，從而使色譜峰產(chǎn)生擴(kuò)散。

分子擴(kuò)散項(xiàng)B/u項(xiàng)其中B=2γDg彎曲因子擴(kuò)散系數(shù)

分子擴(kuò)散項(xiàng)由于分子的縱向擴(kuò)散造成的色譜峰擴(kuò)展。即由于試樣組分被載氣帶入色譜柱后，是以塞子的形式存在于色譜柱的很小一段空間中，由于在塞子前后存在濃度梯度，因此使運(yùn)動(dòng)著的分子產(chǎn)生縱向擴(kuò)散，引起色譜峰擴(kuò)展。

傳質(zhì)阻力項(xiàng)由氣相傳質(zhì)阻力和液相傳質(zhì)阻力兩項(xiàng)組成

氣相傳質(zhì)阻力項(xiàng)Cgu

試樣組分從氣相移動(dòng)到固定相表面的過程中，由于質(zhì)量交換過程需要一定時(shí)間（即傳質(zhì)阻力）而使分子有滯留傾向。在此過程中，部分組分分子隨流動(dòng)相向前運(yùn)動(dòng)，發(fā)生分子超前，引起色譜峰擴(kuò)展。

容量因子

液相傳質(zhì)阻力項(xiàng)CLu

試樣組分從固定相表面移動(dòng)到固定相內(nèi)部再回到表面的過程中，由于質(zhì)量交換過程需要一定時(shí)間（即傳質(zhì)阻力）而使分子有滯留傾向。在此過程中，部分組分分子先離開固定相表面，發(fā)生分子超前，引起色譜峰擴(kuò)展。

液相擴(kuò)散系數(shù)液膜厚度氣相色譜中的速率方程

速率方程給我們的什么啟示？為柱型的研究和發(fā)展提供理論依據(jù)為操作條件的選擇提供理論指導(dǎo)為色譜柱的填充提供理論指導(dǎo)對(duì)柱型研究和發(fā)展的影響（1）A=0?Golay1957年提出毛細(xì)管柱的概念（opentube）毛細(xì)管柱A=0，H=B/u+CuH↓，N↑，分離能力大大提高對(duì)柱型研究和發(fā)展的影響（2）B=0?溶質(zhì)在液體中的擴(kuò)散系數(shù)DL≈10-5cm2/s溶質(zhì)在氣體中的擴(kuò)散系數(shù)Dg≈10-1cm2/sDL《Dg當(dāng)采用液體作流動(dòng)相時(shí)

B→0液體作流動(dòng)相時(shí)可用更細(xì)的固定相，A↓HPLC柱效比GC要高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)操作條件對(duì)柱效的影響（1）H-u曲線載氣線速度（流速）的影響最佳流速：u=(B/C)1/2實(shí)用最佳流速：比最佳流速更快A與流速無關(guān)B/u：當(dāng)流速小時(shí)，對(duì)H的大小起主導(dǎo)作用Cu：當(dāng)流速大時(shí)，對(duì)H的大小起主導(dǎo)作用容量因子k的影響不同組分k不同，測(cè)出的柱效不同在氣相傳質(zhì)阻力相中，k↑

，Cg↑理論上說k越小柱效越高，實(shí)際不可取在液相傳質(zhì)阻力相中，k↑，Cl先↑，后↓當(dāng)k=1時(shí)，最大。希望k在一個(gè)合適的范圍內(nèi)，通過改變柱溫、固定相、柱型參數(shù)等可實(shí)現(xiàn)。柱溫的影響間接影響、十分復(fù)雜對(duì)k影響，對(duì)擴(kuò)散系數(shù)影響，從而對(duì)柱效產(chǎn)生影響，但影響情況難以判斷對(duì)色譜柱的填充提供理論指導(dǎo)（1）柱徑：柱徑越小，固定相越難填充均勻。柱長(zhǎng)L：柱長(zhǎng)增加，總塔板數(shù)增加，但分離時(shí)間將增加。固定相粒徑dp：根據(jù)速率方程，粒徑減小，A項(xiàng)減小，C項(xiàng)減小，柱效增加。但粒徑太小，不易填充均勻，A項(xiàng)又增大。對(duì)色譜柱的填充提供理論指導(dǎo)（2）液膜厚度df：從柱效角度考慮，液膜越薄，柱效越高（根據(jù)速率方程），但允許的進(jìn)樣量減小。（1）幾個(gè)概念——選擇性系數(shù)α定義與相對(duì)保留值(ri,s)基本相同不同之處在于選擇性系數(shù)是兩個(gè)相鄰峰的調(diào)整保留值之比（后峰比前峰，α≥1），而不是被測(cè)物與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的調(diào)整保留值之比（可小于1）它是評(píng)價(jià)固定液選擇性的指標(biāo)。選擇性系數(shù)越大，該柱對(duì)此相鄰峰的分離越好。

幾個(gè)概念——有效塔板數(shù)N有效在氣相色譜中，通常用有效塔板數(shù)N有效和有效塔板高度H有效來評(píng)價(jià)柱子的分離效能，它扣除了死體積對(duì)分離的影響，更好地反映了柱子的實(shí)際分離效能。柱效越高，該柱的分離能力越好。幾個(gè)概念——分離度RR越大，說明兩組分分離得越好。由于該定義綜合了色譜動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)因素，可作為色譜柱的總分離效能指標(biāo)。(2)色譜分離基本方程（Purnell方程）

公式推導(dǎo)（3）色譜分離基本方程的啟示要改善物質(zhì)對(duì)的分離（提高R），即提高兩相鄰物質(zhì)的分離度，可以采取以下措施：提高柱效N提高選擇性系數(shù)α增大容量因子kN的影響，如何提高N？分離度R與理論塔板數(shù)N的平方根成正比關(guān)系，增加塔板數(shù)，有利于提高分離度。增加柱長(zhǎng)可增加N，改善分離，但分析時(shí)間將大大延長(zhǎng)，峰產(chǎn)生擴(kuò)展。減小塔板高度H：根據(jù)速率方程的啟示制備一根性能優(yōu)良的色譜柱是十分重要的。根據(jù)速率方程選擇合適的色譜條件同樣有效。K的影響，如何改變k？分離度與容量因子有關(guān)，容量因子越大，分離越好。

k135791113∞但當(dāng)容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時(shí)間將大大延長(zhǎng)。因此，k的最佳范圍是1<k<10。改變?nèi)萘恳蜃拥姆椒ㄓ校焊淖冎鶞馗淖兿啾?，即改變固定相的量和改變柱死體積，其中死體積對(duì)k/(k+1)的影響很大，使用死體積大的柱子，分離度將受到很大損失。在高效液相色譜中改變流動(dòng)相的配比是最簡(jiǎn)便、最有效的方法α的影響，如何改變?chǔ)?？αN有效R=1.0R=1.51.001.0051.011.021.051.101.251.502.00∞650000163000420007100190040014065∞145000036700094000160004400900320145相對(duì)保留值（選擇性因子）α越大，分離效果越好。增大α是提高分離度最有效的手段。改變柱溫也可改變?chǔ)?。在氣相色譜中，增大α最有效的手段是改變固定相，選擇合適的固定相種類是解決分離問題的關(guān)鍵在高效液相色譜中，流動(dòng)相的種類和配比是改善分離最簡(jiǎn)便有效的方法。（4）分離度究竟要多大？一般來說R應(yīng)大于。具體工作中應(yīng)根據(jù)樣品要求和定量方法來確定。例如：含量50%的組分，要使峰高定量誤差小于1%，需達(dá)到R1/2，而采用峰面積定量R1/2需。含量1%的組分，要使峰高定量誤差小于1%，需達(dá)到R1/2，而采用峰面積定量R1/2需。3.氣相色譜操作條件的選擇流速柱溫氣化溫度檢測(cè)器溫度進(jìn)樣量載氣種類固定相種類流速u（Fc）根據(jù)速率方程，可計(jì)算求出最佳流速，此時(shí)柱效最高。在實(shí)際工作中，為縮短分析時(shí)間，往往使流速稍高于最佳流速。具體的：對(duì)于填充柱，氮?dú)獾膶?shí)用最佳線速為10-15cm/s；氫氣為15-25cm/s；氦氣介于兩者之間。若填充柱內(nèi)徑為4mm，則體積流速為氮?dú)?0-40ml/min，氫氣40-60ml/min。柱溫Tc直接影響分析效能和分析速度。每一種固定液都有它的最高使用溫度，柱溫不可超過這一溫度，否則固定液揮發(fā)流失。柱溫太高，組分揮發(fā)度靠攏，不利于分離。但柱溫太低，被測(cè)組分的擴(kuò)散速度下降，分配不能快速達(dá)到平衡，影響峰型，柱效下降，并使分析時(shí)間大大延長(zhǎng)。柱溫選擇的原則是，在保證難分離物質(zhì)有良好分離的前提下（分離度滿足要求），盡可能采取較高柱溫，以縮短分析時(shí)間，保證峰型對(duì)稱。汽化溫度一般進(jìn)樣方法下，汽化溫度比柱溫高30-70℃。進(jìn)樣量大時(shí)高一些好，保證瞬間汽化。保證不可超過試樣的分解溫度。其它氣化溫度與具體進(jìn)樣方式有關(guān)。檢測(cè)器溫度一般大于或等于柱溫，具體與檢測(cè)器種類有關(guān)。進(jìn)樣量液體試樣一般進(jìn)樣量。氣體試樣一般進(jìn)樣量為。具體視柱類型，固定液含量（不能超過柱容量）、進(jìn)樣方式、檢測(cè)器的靈敏度和線性范圍等確定。流動(dòng)相（載氣）種類流動(dòng)相的種類要視檢測(cè)器種類確定。常用的有氫氣（熱導(dǎo)用）、氮?dú)猓浠鹧嬗茫?、氦氣（均可用，但價(jià)格較高）。氫氣和氦氣適合于快速分析。氮?dú)庾鲚d氣峰型較好，柱效較高。三、色譜定性與定量方法1.色譜定性分析(1)利用保留值及其規(guī)律定性各物質(zhì)在一定的色譜條件下均有確定不變的保留值，因此保留值可作為定性指標(biāo)。利用純物對(duì)照定性利用文獻(xiàn)值對(duì)照定性純物質(zhì)對(duì)照定性實(shí)現(xiàn)方法利用保留時(shí)間和保留體積定性

用相對(duì)保留值定性

用已知物增加峰高法定性

應(yīng)用范圍：適用于簡(jiǎn)單混合物，對(duì)該樣品已有了解并具有純物質(zhì)的情況。優(yōu)點(diǎn)：應(yīng)用簡(jiǎn)便，不需要其他儀器。缺點(diǎn)：定性結(jié)果的可信度不高。提高可信度的方法：雙柱、雙體系定性文獻(xiàn)值對(duì)照定性分析（GC）實(shí)現(xiàn)方法測(cè)定相對(duì)保留值ri,s測(cè)定保留指數(shù)I

優(yōu)點(diǎn)：無需純物質(zhì)；保留指數(shù)具有較好的重現(xiàn)性和精密度；只與固定相和柱溫有關(guān)。缺點(diǎn)：對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的物質(zhì)，缺乏數(shù)據(jù)。

適用范圍：適用于簡(jiǎn)單混合物，無需純物質(zhì)。(2)與其它儀器或化學(xué)方法聯(lián)合定性離線聯(lián)用方式化學(xué)法儀器法在線聯(lián)用方式化學(xué)法儀器法離線聯(lián)用方式收集方法：GC中一般采用液氮冷阱冷卻后收集應(yīng)用范圍：無標(biāo)準(zhǔn)物時(shí)，可對(duì)較為復(fù)雜的混合物進(jìn)行定性分析缺點(diǎn)：麻煩在線聯(lián)用方式用化學(xué)方法輔助定性柱前反應(yīng)：在色譜柱前裝上預(yù)處理柱，帶有某些官能團(tuán)的化合物在預(yù)柱中發(fā)生物理化學(xué)變化，其色譜峰會(huì)消失或移動(dòng)，與反應(yīng)前色譜圖比較，可初步判斷試樣中含那些官能團(tuán)。柱后反應(yīng)：在色譜柱后裝上Ｔ型毛細(xì)管分流器，將各組分導(dǎo)入官能團(tuán)試劑反應(yīng)管，利用官能團(tuán)反應(yīng)對(duì)組分進(jìn)行定性。與其它儀器聯(lián)用定性

混合物經(jīng)色譜分離后，將各組分直接由接口導(dǎo)入其它儀器中進(jìn)行定性。常用的聯(lián)用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS……

其它儀器相當(dāng)于色譜儀的檢測(cè)器。使用范圍：復(fù)雜樣品的定性。優(yōu)點(diǎn)：不需要標(biāo)準(zhǔn)物，定性結(jié)果可信度高，操作方便。缺點(diǎn)：需要特殊儀器或設(shè)備。GC-MS2色譜定量分析(1)色譜定量基礎(chǔ)色譜定量分析是基于被測(cè)物質(zhì)的量與峰面積成正比。在一定色譜條件下有：（2）定量要解決的問題峰面積的測(cè)量和計(jì)算校正因子的測(cè)量與計(jì)算色譜定量方法及其應(yīng)用峰面積的測(cè)量與計(jì)算積分儀或色譜工作站簡(jiǎn)便、速度快，精度