禽流感細(xì)胞滅活苗的研究及H9亞型禽流感病毒感染豬的血清學(xué)調(diào)查

禽流感細(xì)胞滅活苗的研究及H9亞型

禽流感病毒感染豬的血清學(xué)調(diào)查碩士學(xué)位論文答辯研究背景:文獻(xiàn)綜述禽流感細(xì)胞滅活疫苗的研究H9亞型禽流感感染豬的血清學(xué)調(diào)查

報(bào)告內(nèi)容一、研究背景

1.1禽流感疫苗的研究進(jìn)展全病毒滅活疫苗

基因工程亞單位疫苗

重組活載體疫苗

核酸疫苗

流感減毒活疫苗

禽流感疫苗冷適應(yīng)減毒活疫苗

重配減毒活疫苗基因工程減毒活疫苗

復(fù)制缺陷型流感減毒活疫苗表位疫苗

通用疫苗1.2禽流感檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

病毒的分離鑒定

瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）血凝（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）

神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（NIT）病毒中和試驗(yàn)（NT）

免疫熒光技術(shù)（IFT）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

分子生物學(xué)診斷技術(shù)

禽流感的檢測(cè)方法二、禽流感細(xì)胞滅活疫苗的研究滅活疫苗安全性好，免疫原性強(qiáng)，給免疫雞群提供良好的免疫保護(hù)。目前已得到廣泛的應(yīng)用。細(xì)胞苗與傳統(tǒng)的雞胚苗相比，抗原性更接近自然流行株，可減少宿主蛋白成分，減少變態(tài)反應(yīng)，避免雞胚傳代后引起抗原性變異。本試驗(yàn)將禽流感病毒H5N1接種MDCK細(xì)胞，通過收獲細(xì)胞病變液經(jīng)滅活制成細(xì)胞滅活疫苗，為HPAI的防控提供新的疫苗儲(chǔ)備。

2.1研究的目的和意義敏感細(xì)胞株的篩選

高效價(jià)病毒毒株的篩選

病毒增殖滴度的研究

禽流感細(xì)胞苗的制備

病毒滅活效果檢驗(yàn)疫苗物理性狀檢驗(yàn)疫苗的無菌檢驗(yàn)疫苗安全性試驗(yàn)免疫保護(hù)力試驗(yàn)抗體消長規(guī)律試驗(yàn)疫苗保存期試驗(yàn)技術(shù)路線2.2試驗(yàn)方法、結(jié)果與分析敏感細(xì)胞株的篩選

代次細(xì)胞F1F2F3F4F5CEF2626252625MDCK2928282729Vero2525262422BHK-21232324240“2n”表示血凝價(jià)為nlog2

表2-1禽流感病毒在4種細(xì)胞上的血凝價(jià)結(jié)果表明，病毒在MDCK細(xì)胞上增殖的血凝價(jià)最高，達(dá)到27以上，且比較穩(wěn)定。病毒在CEF、Vero和BHK細(xì)胞上的增殖滴度都比較低在26以下，也不適于選用。因此我們選用MDCK細(xì)胞用于細(xì)胞苗制備的細(xì)胞系。禽流感病毒接種MDCK細(xì)胞后20～36h開始出現(xiàn)呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變正常的MDCK細(xì)胞排列整齊，界限清晰病變的細(xì)胞變圓，脫落、顆粒增多，成片細(xì)胞之間有絲相連，成“拉網(wǎng)”結(jié)構(gòu)。圖2-1正常MDCK細(xì)胞與細(xì)胞病變

穩(wěn)定、高效價(jià)病毒毒株的篩選F1F2F3F4F5F6F7F8F9F10XSHA262625252625242300TCID5010-6.010-6.110-5.810-5.510-4.810-5.210-4.010-3.100JXHA2525242425242323220TCID5010-5.210-5.010-4.510-4.010-4.010-4.210-4.210-3.000XFYHA26252524242425232423TCID5010-4.310-4.010-4.010-3.510-4.510-3.010-4.010-4.010-3.510-3.5DWHA292828272728282928210TCID5010-7.010-7.110-7.510-7.510-7.010-7.210-7.110-7.510-7.110-7.5表2-24個(gè)AIV毒株在MDCK上傳10代后的血凝HA效價(jià)和TCID50（TCID50/0.1mL）毒株XS、JX和XFY的血凝價(jià)和TCID50較低且不穩(wěn)定，隨著連續(xù)傳代呈下降趨勢(shì)。DW毒株的血凝價(jià)最高達(dá)210

，TCID50≧10-7.0/0.1mL。因此我們確定DW毒株為制苗用毒株。A/Chicken/HuBei/327/2002(H5N1)

病毒增殖滴度的研究

AIV代次F1F2F3F4F5F6F7F8F9F10血凝價(jià)28282727262828282829TCID5010-6.810-6.810-7.010-7.110-7.510-7.210-7.510-7.310-7.310-7.8AIV代次F11F12F13F14F15F16F17F18F19F20血凝價(jià)28292122122102928282929TCID5010-7.510-7.410-7.510-7.810-7.510-7.510-7.810-7.710-7.610-7.7AIV代次F21F22F23F24F25F26F27F28F29F30血凝價(jià)210292921029282112921029TCID5010-7.510-7.410-7.510-7.610-7.910-7.810-7.810-7.410-7.810-7.5表2-3不同代次禽流感病毒在MDCK細(xì)胞上的血凝價(jià)和TCID50（TCID50/0.1mL）結(jié)果表明H5N1毒株經(jīng)MDCK細(xì)胞接種培養(yǎng)30代后，血凝價(jià)穩(wěn)定在28以上，TCID50穩(wěn)定在10-7.0/0.1mL以上。隨著代次的增加，血凝價(jià)和TCID50都逐漸上升且穩(wěn)定，為疫苗的制備提供了高免疫原性的抗原。病毒的滅活及滅活效果檢驗(yàn)滅活：以終濃度為0.4％的甲醛溶液滅活。滅活檢驗(yàn)：將滅活的病毒液接種9～10日齡雞胚，盲傳3代后，全部雞胚發(fā)育正常。說明病毒滅活徹底，保證了疫苗的生物安全。疫苗的安全性試驗(yàn)安全性試驗(yàn)：用制備的細(xì)胞滅活苗雙倍劑量接種28日齡H5-AIV抗體陰性雞10只，0.4mL/只，雞群未出現(xiàn)異常反應(yīng)和局部損傷。說明所制備的細(xì)胞苗安全性良好。疫苗的免疫保護(hù)力試驗(yàn)組別免疫劑量攻毒時(shí)間攻毒劑量免疫保護(hù)力健活數(shù)死亡數(shù)H5細(xì)胞滅活苗0.2mL免疫后21天0.2mL8/80/8H5尿囊液毒滅活苗8/80/8禽流感滅活苗（N28株，哈獸研）8/80/8空白對(duì)照（無菌DMEM培養(yǎng)基）0/88/8將疫苗免疫H5抗體陰性雞21d測(cè)得HI抗體水平達(dá)到29，用100LD50的H5N1-AIV進(jìn)行攻毒。表2-4各免疫組攻毒保護(hù)試驗(yàn)

結(jié)果表明，各免疫組雞全部健活，保護(hù)率為100%?？瞻讓?duì)照組雞攻毒后24h開始出現(xiàn)精神萎靡、流淚、呼吸困難、顏面水腫、羽毛松散等癥狀，并出現(xiàn)死亡，在5天內(nèi)全部死亡。說明研制的H5亞型禽流感病毒細(xì)胞滅活苗免疫效果良好，與尿囊液滅活苗和禽流感滅活苗（N28株，哈獸研）的免疫保護(hù)率相當(dāng)，可以對(duì)同亞型的病毒攻擊起到保護(hù)作用?？贵w消長規(guī)律試驗(yàn)

疫苗免疫后7天開始檢測(cè)到抗體，至第3周抗體水平上升較快，HI效價(jià)均達(dá)到29以上。從第3周至第7周，抗體水平持續(xù)緩慢地上升至29～211。到第8周抗體水平開始緩慢下降，至36周細(xì)胞苗組的抗體在25左右?？瞻讓?duì)照組雞的抗體一直在24以下，禽流感抗體陰性。說明制備的細(xì)胞苗免疫效果可以維持9個(gè)月以上。HI效價(jià)(log2)免疫后時(shí)間（周）

保存期試驗(yàn)

存放時(shí)間HI抗體7d14d21d28d35d60d6個(gè)月25.226.029.8210.129.829.210個(gè)月25.026.229.5210.029.829.0對(duì)照組000000疫苗保存10個(gè)月后免疫雞，28d高峰可達(dá)210.0。因此該疫苗保存期暫定10個(gè)月（4-8℃）。

將疫苗置于4℃保存6、10個(gè)月后均未出現(xiàn)分層破乳現(xiàn)象。疫苗免疫雞后，無不良反應(yīng)。

表2-5保存期試驗(yàn)結(jié)果免疫抗體水平

2.3小結(jié)本試驗(yàn)篩選了MDCK細(xì)胞和DW毒株A/Chicken/HuBei/327/2002(H5N1)為本試驗(yàn)制苗用細(xì)胞系和毒株。研制了H5亞型禽流感細(xì)胞滅活苗，并對(duì)其免疫效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，該疫苗對(duì)同亞型病毒的攻擊能提供100%保護(hù)?？贵w持續(xù)時(shí)間達(dá)到9個(gè)月，4℃保存期為10個(gè)月。三、H9亞型禽流感感染豬的血清學(xué)調(diào)查3.1研究的目的和意義禽流感已突破種屬障礙感染人并致人死亡。H9N2在豬中也分離到，且能直接感染人。豬是禽流感病毒和其他流感病毒的混合器，在禽－豬－人的種間傳播中起到非常重要的作用。做好對(duì)豬群的監(jiān)測(cè)，建立一套早期預(yù)警體系，即可提前預(yù)報(bào)流感大流行。本實(shí)驗(yàn)利用建立的H9HA-ELISA診斷方法，對(duì)來自湖北、湖南和安徽三省的949份豬血清進(jìn)行了血清學(xué)分析。技術(shù)路線抗原的制備抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定陰陽性界線的確定分析特異性試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)符合率試驗(yàn)診斷特異性試驗(yàn)診斷敏感性試驗(yàn)ELISA診斷方法的建立豬的血清學(xué)檢測(cè)

H9-HA蛋白SDS結(jié)果

圖3-1原核表達(dá)載體pKG-H9HAM誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS檢測(cè)1:pKG-H9HAM;2:pGEX-KG結(jié)果顯示：含pKG-H9HAM重組質(zhì)粒的E.coliBL21在約90KDa處有明顯的表達(dá)帶，H9HA蛋白約63KDa，與GST融合后約為90KDa。而含pGEX-KG的E.coliBL21的對(duì)照在約26KDa有明顯的表達(dá)帶，相當(dāng)于GST蛋白的分子量。說明目的基因獲得了表達(dá)。

3.2試驗(yàn)方法、結(jié)果與分析ELISA抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定AgDilutionSerumDilutionABCDEFGH1:101:201:401:801:1601:3201:6401:1280+11：102.0111.8021.7961.6131.5641.5321.2011.01821：201.9211.7191.6161.5991.5541.5191.0780.93531：401.8221.6831.6591.5161.5141.4580.9760.84541：801.8101.6171.6511.4631.4461.1730.6700.45151：1601.5981.5081.5571.1271.0310.6530.4130.35561：3201.4271.3421.4161.0160.7730.4620.4180.311_71：100.5010.4540.3520.2620.2530.1780.1760.13581：200.4840.4670.2490.2350.2060.1390.1080.09891：400.4450.4460.2590.2080.1840.0670.0590.045101：800.4180.4080.2150.1510.1240.0780.0550.057111：1600.3650.3540.1260.0920.0630.0290.0410.045121：3200.2470.2760.1030.0530.0400.0180.0210.021表3-1ELISA方陣滴定結(jié)果

ELISA陰陽界限的確定

將臨床送檢經(jīng)HI檢測(cè)為陰性的100份豬血清，進(jìn)行ELISA檢測(cè)均為陰性，計(jì)算該100份血清的OD630nm平均值X=0.143，標(biāo)準(zhǔn)差SD=0.087，因而根據(jù)公式X+3SD求得陰陽界限為0.404。結(jié)果判定：以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔OD630nm值

OD630nm≥0.404判為陽性；

OD630nm＜0.404判為陰性。重復(fù)性試驗(yàn)批內(nèi)重復(fù)的吸收變異系數(shù)C.V在4.9％-8.4％之間；批間重復(fù)的吸收變異系數(shù)C.V在5.3％-9.5％之間。說明該診斷方法具有良好的重復(fù)性。分析特異性試驗(yàn)

血清陽性血清血清樣品12345678910OD6300.1020.1230.0980.1040.0890.1010.1110.0791.3050.1031)弓形蟲；2)豬瘟；3)胸膜肺炎；4)口蹄疫病毒；5)偽狂犬病毒；6)細(xì)小病毒；7)乙腦病毒；8)豬繁殖與呼吸道綜合癥；9)豬抗H9-AIV陽性血清；10)陰性血清上述結(jié)果表明該ELISA方法檢測(cè)弓形蟲、豬瘟等8種豬病陽性血清均無交叉反應(yīng)，檢測(cè)H9-AIV豬陽性血清結(jié)果為陽性，陰性血清結(jié)果為陰性，表明該方法的分析特異性良好。表3-4分析特異性試驗(yàn)結(jié)果診斷特異性、敏感性與符合率試驗(yàn)

血凝抑制試驗(yàn)（HI）合計(jì)＋－ELISA＋14225167－11236247合計(jì)153261414根據(jù)公式計(jì)算得該ELISA方法的診斷敏感性為92.8%；特異性為90.4%；總符合率為91.3％說明該方法具有良好的診斷特異性、敏感性與符合率。表3-5ELISA方法的診斷特異性、敏感性與符合率豬的血清學(xué)調(diào)查

湖北湖南安徽2-3月份9-10月份2-3月份9-10月份2-3月份9-10月份哺乳仔豬檢測(cè)數(shù)434045313235陽性數(shù)211001陽性率4.7%2.5%2.2%0.0%0.0%2.9%保

育豬檢測(cè)數(shù)404129413642陽性數(shù)320011陽性率7.5%4.9%0.0%0.0%2.8%2.4%育

肥

豬檢測(cè)數(shù)503843474538陽性數(shù)303243陽性率6.0%0.0%7.0%4.3%8.9%7.9%種豬