色譜技術(shù)教學(xué)文案

色譜技術(shù)3根據(jù)流動相的物態(tài)不同的分類：

液相色譜（LC）：LLC、LSC反相色譜：固定相極性小于流動相4根據(jù)流動相與固定相的極性分類：

正相色譜：固定相極性大于流動相氣相色譜（GC）：GLC、GSC2/7/202322.色譜分離的基本原理任何色譜分離過程實(shí)質(zhì)上都是溶質(zhì)隨流動相流動而遷移的過程，不同溶質(zhì)在流動相和固定相中的分配比例不同，因而隨流動相遷移的速度不同，從而使不同物質(zhì)分離開來。2/7/202332.1色譜分離的基本原理（1）分配系數(shù)：溶質(zhì)在固定相與流動相濃度比值可由Langmuir方程得出Kd---分配系數(shù)q、c---溶質(zhì)在固相和液相中的濃度2/7/20234（2）阻滯因子Rf

定義：阻滯因子是在色譜系統(tǒng)中溶質(zhì)的移動速度和標(biāo)準(zhǔn)物（與固定相沒有親和力的流動相Kd=0）的遷移率之比

意義：在于體現(xiàn)某一種溶質(zhì)與固定相之間的親和力大小2/7/202352.2色譜圖及基本概念（1）色譜圖：混合液中各組分經(jīng)色譜柱分離后，隨流動相依次流出色譜柱進(jìn)入監(jiān)測器，監(jiān)測器的響應(yīng)信號－時(shí)間（或流動相體積）曲線，稱為色譜圖或色譜流出曲線。（2）基線：在操作條件下，色譜柱出口沒有組分流出，僅有流動相流過監(jiān)測器，此時(shí)流出的曲線。（3）色譜峰：當(dāng)樣品中的組分隨流動相流入監(jiān)測器時(shí)，監(jiān)測器的響應(yīng)信號隨時(shí)間變化所形成的峰形圖形。（4）峰形：對稱于峰尖的正態(tài)分布曲線。拖尾峰、前伸峰2/7/20236洗脫曲線返回2/7/20237（5）洗脫體積色譜柱中，使溶質(zhì)從柱中流出所需流動相體積，為洗脫體積不同的溶質(zhì)，由于和固定相的親和力的不同，洗脫體積也有所差異2/7/20238（6）保留值保留值：混合物中各組分在色譜柱中停留的時(shí)間或?qū)⒔M分帶出色譜柱所需流動相體積的數(shù)值保留時(shí)間（tR）：從開始進(jìn)樣至柱出口處被測組分出現(xiàn)濃度最大值所需要的時(shí)間。死時(shí)間（t0）：不被固定相滯留的組分（空氣等），從開始進(jìn)樣至出口處被測組分出現(xiàn)濃度最大值所需要的時(shí)間。校正保留時(shí)間（tR’）：扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間。（tR’＝tR-

t0）保留體積（VR）、死體積（V0）、校正保留體積（VR’）相對保留值（r2，1）：在相同操作條件下，待測組分與參比組分的校正保留值之比。2/7/20239

(7)分離度：相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組色譜峰峰底寬度平均值之比。峰寬（W）：兩側(cè)拐點(diǎn)處所作的切線與峰底相交于兩點(diǎn)，此兩點(diǎn)的距離。（見圖）半高峰寬（W1/2)：1/2峰高處的峰寬。峰高：峰頂點(diǎn)與峰底的垂直距離。峰面積：峰與峰底之間的面積。標(biāo)準(zhǔn)偏差（σ）：0.607h峰高處的峰寬的1/2區(qū)域?qū)挾龋ǚ鍖?、半高峰寬、?biāo)準(zhǔn)偏差）W=4σ

R≥1完全分離2/7/202310（8）色譜柱的理論塔板：流動相與固定相平均濃度達(dá)傳質(zhì)平衡時(shí)的一段柱高（塔板高度）反應(yīng)不同時(shí)刻溶質(zhì)在色譜柱中的分布以及分離度與柱高之間的關(guān)系理論塔板數(shù)的計(jì)算方法：N---理論塔板數(shù)tR---保留時(shí)間W1/2---半峰寬Wb---峰底寬度理論塔板高度：HL---柱長2/7/2023113.色譜系統(tǒng)的基本組成2/7/202312Pharmacia?KTA層析系統(tǒng)2/7/202313調(diào)糊預(yù)裝一定量的溶劑或緩沖液連續(xù)加入懸膠液打開出口閥：層析劑沉降排除空氣檢查均勻度4.色譜分離操作（1）裝柱與平衡2/7/202314（2）上樣（吸附）樣品處理：(1）溶解A.調(diào)整濃度B.鹽C.pH(2)過濾：除去不溶物流速：根據(jù)樣品濃度與吸附速度而定上樣量：80%吸附容量2/7/202315（3）淋洗鹽濃度pH表面活性劑（0.1-0.5%)淋洗體積：根據(jù)流出液雜蛋白濃度而定防止產(chǎn)物丟失又要除去雜質(zhì)2/7/202316（4）洗脫方法按操作方式a恒定洗脫(isocraticelution)b分步洗脫(stageelution)c梯度洗脫(gradientelution)按洗脫機(jī)理專一性洗脫（specificelution）非專一性洗脫（nonspecificelution）添加劑：乙二醇,NaCNS、脲素、鹽酸胍洗脫體積：5倍床體積2/7/202317（5）清洗與再生弱酸：HAc堿：氨水促溶劑：1-3MKCNS，6-8M尿素，6M鹽酸胍極性溶劑：20%乙醇表面活性劑：吐溫-80緩沖液平衡2/7/202318離子交換色譜凝膠過濾吸附色譜親和色譜分配色譜疏水作用層析5各種色譜技術(shù)介紹2/7/202319（1）離子交換色譜原理：以離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的緩沖液為流動相，使溶質(zhì)按照其離子交換親合力的不同而得到分離的方法。2/7/202320常用的離子交換劑葡聚糖凝膠型

DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25纖維素系列離子交換劑瓊脂糖系列離子交換劑

Sepharose系列SepharoseCL-6BBio-GelA系列交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑大孔性離子交換劑

2/7/202321離子交換柱層析操作①樹脂的選擇②樹脂的預(yù)處理及轉(zhuǎn)型③裝柱及平衡（要保持均勻、無氣泡和斷層）

首先加入1/3h的起始緩沖液或水；其次加入樹脂使樹脂借助水的浮力緩慢自然沉降；最后用水或緩沖液平衡到所需要的條件，如特定pH、離子強(qiáng)度等。④上樣：將溶解在少量溶劑中的試樣加到柱上部⑤洗滌與洗脫：改變pH或離子強(qiáng)度

⑥收集與檢測2/7/202322怛定洗脫2/7/202323分步洗脫2/7/202324(c)梯度洗脫2/7/202325（2）凝膠過濾①原理：凝膠過濾所用的基質(zhì)具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，篩孔直徑一致，且呈珠裝顆粒物質(zhì)，這種物質(zhì)可以完全或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而不能排阻某些小分子化合物，但可讓其在篩孔中自由擴(kuò)散和滲透。因此，混合物分子大小不同，通過介質(zhì)所需阻力不同，從而被分離。流出順序：大分子→中等分子→小分子2/7/2023262/7/202327在樣品通過一定孔徑的凝膠固定相時(shí)，由于流經(jīng)體積的不同，使不同相對分子量的組分得以分離②優(yōu)點(diǎn)：

操作簡便 分離效果好，重復(fù)性高，回收率高 分離條件溫和，不會使物質(zhì)變性 凝膠不用再生，可反復(fù)使用缺點(diǎn)：分離速度較慢、選擇性低（僅分子量大小）、料液處理量少2/7/202328③分配系數(shù)a.公式b.大?。抛璩潭龋?－100%)Vt(床體積）＝πr2h

＝外水體積（V0）+內(nèi)水體積（Vi）+顆粒實(shí)際占有體積(Vg)(i)完全排阻組分Kav＝0Ve＝V0（ii）部分排阻組分Kav（0-1）（iii）完全進(jìn)入膠孔組分Kav＝1Ve＝Vt2/7/202329④凝膠過濾介質(zhì)葡聚糖凝膠（sephadex）由葡聚糖+環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成

sephadexG1015255075100200瓊脂糖凝膠（Sepharose）－天然凝膠

Sepharose2B4B聚丙烯酰胺凝膠（Bio－Gel）

Bio－Gelp2p4p100等（編號×100為排阻現(xiàn)）疏水性凝膠應(yīng)用：分離、濃縮；脫鹽；測定分子量2/7/202330（3）吸附色譜①原理:利用溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力(范德華力，包括色散力、誘導(dǎo)力、定向力以及氫鍵)的差異而實(shí)現(xiàn)分離。（吸附－解吸－再吸附連續(xù)過程）②分類：柱色譜和薄層色譜③分配系數(shù)（K）與遷移率（Rf）關(guān)系

K大，Rf小

K小，Rf大2/7/202331④柱色譜的操作－吸附劑的選擇（1）依據(jù)a.比表面積大b.顆粒均勻c.穩(wěn)定性強(qiáng)d.成本低e.分辨率高（對不同的物質(zhì)有不同的解吸能力）如：極性吸附劑易吸附極性化合物；但便于解吸，極性化合物，應(yīng)選擇極性較小的吸附劑2/7/202332（2）吸附劑：氧化鋁、硅膠、聚酰胺等，均含有不飽和的氧原子或氮原子以及能夠形成氫鍵的基團(tuán)，如-OH和-NH2色譜柱的選擇a.平直、均勻；D：L＝1：10－40；砂芯或玻璃棉b.分辨率低，選長柱；D大，L大2/7/202333④柱色譜的操作－洗脫劑的選擇（1）原則純度高、穩(wěn)定性好、對樣品溶解度大，易與其它組分分開（2）常用硅膠、氧化鋁：洗脫劑極性小→極性大活性炭或非極性大孔樹脂：洗脫劑極性大→極性小羥基磷灰石（吸附蛋白質(zhì)）：鹽緩沖液洗脫2/7/202334薄層吸附色譜展開劑極性越大，對同一化合物的洗脫能力越大因此，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整展開劑的極性以獲得最佳的分離的效果展開劑選擇的原則：（1）對被分離組分應(yīng)具有一定的解吸附能力，極性應(yīng)比被分離物質(zhì)的極性略?。?）展開劑應(yīng)對被分離物質(zhì)具有一定的溶解能力2/7/202335薄層吸附色譜（操作）制板：硅膠G板，硅膠CMC板點(diǎn)樣：少量多次、D＜3mm、邊1.5－2cm展開：密閉容器、提前配好展開劑；溶劑不能浸沒樣品點(diǎn)；展完后劃前沿及樣品移動距離檢測：紫外線照射；噴霧顯色；碘蒸汽等2/7/202336（4）分配色譜原理：固定相為因吸附等作用而滯留于固體載體表面的一薄層液體，利用溶質(zhì)在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同而分離的方法要素：固定相、載體、流動相2/7/202337載體：通常為惰性材料，能吸附固定相液體載體種類：硅膠:含水量大于17％或以水為展開劑時(shí)，硅膠失去了直接吸附溶質(zhì)的能力，在硅膠表面附著的水作為固定相，因而為分配色譜硅藻土纖維素葡聚糖凝膠2/7/202338（5）親和色譜

利用高分子化合物可以和與它們相對應(yīng)的配基，進(jìn)行特異并可逆結(jié)合的特點(diǎn)來