分子生物學的基本竟能和策略課件

周俊宜

分子生物學基本技能和策略生化技術電泳層析離心分光光度基因操作其它基因工程

分切接轉篩表

電泳層析離心分光光度基因操作其它

分（離目的基因）切（割目的基因和載體）

接（連目的基因和載體）

轉（化宿主細胞）

篩（選陽性克隆）表（達目的基因）基本模式“縱向”體系“橫向”體系基因工程原理基因重組：不同的DNA分子間發(fā)生共價連接形成重組DNA分子。重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段1972年,P.Berg:構建第一個DNA重組分子1997年,動物克隆:克隆羊多莉1977年，基因工程產(chǎn)品的出現(xiàn)

H.W.Boyer,第一個基因工程產(chǎn)品(SS)1973年,S.S.Cohen:第一個基因克隆實驗2001年，人類基因組計劃pSC101抗四環(huán)素pR6-5抗卡那霉素DNA連接酶重組DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因培養(yǎng)平皿卡那霉素基因四環(huán)素\卡那霉素基因大腸桿菌四環(huán)素平板抗四環(huán)素抗卡那霉素抗四環(huán)素\抗卡那霉素大腸桿菌SS蛋白重組體+SS基因大腸桿菌SS蛋白重組體+SS基因目的基因基因載體

目的基因基因載體重組體分切接轉篩表總體技術路線1）化學合成法：較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物測序引物定點突變核酸雜交探針2）基因文庫限制性內(nèi)切酶……克隆、轉化、培養(yǎng)、鑒定基因組DNA基因文庫基因組DNA文庫限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉化細菌體外包裝引物引物3’5’5’5’3）PCR技術基因組PCR技術的基本過程模板DNAdNTP引物Buffer預變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循環(huán)儀94oC5’94℃55℃72℃2載體DNA的選擇功能：

為目的基因提供進入受體細胞的轉移能力。為目的基因提供在受體細胞中的復制能力或整合能力。為目的基因提供在受體細胞中的擴增和表達能力。理想載體的基本條件：可轉移性合適的復制位點多克隆位點：廣泛、特異選擇標志，便于篩選和鑒定分子較小，可容納較大的外源DNA質(zhì)粒噬菌體腺病毒載體逆轉錄病毒載體……種類：宿主細胞ori抗Amp宿主細菌含Amp培養(yǎng)基多種酶切口多克隆位點限制性內(nèi)切酶單一酶切口多克隆位點ori復制起始點遺傳標記Amppolylinker基因載體

噬菌體載體50kb+LARALARAEcoRⅠEcoRⅠlacZcI限制性內(nèi)切酶酶切切酶切限制性內(nèi)切核酸酶

在特異位點上切割DNA分子分三類，常用為Ⅱ類酶識別序列呈回文對稱命名：酶來源的生物名稱縮寫屬名-種名-株名-發(fā)現(xiàn)次序

5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的識別序列HaeⅠ的識別序列5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的識別序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的識別序列和酶切切口（平端）磷酸二酯鍵的形成DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶目的基因與載體的連接接

T4-DNA連接酶：T4-噬菌體連接溫度：不高于粘性末端熔點溫度（Tm）≤15℃：15℃/6h；12℃/8h；8℃/12h；連接方式：

相同粘性末端的連接平頭末端的連接不同粘性末端的連接人工粘性末端的連接

粘端連接CCGGCCGGGGCCGGCC

CGGC

CGGCCGGC

CGGC

CCGG

GGCCHapⅡT4-DNA連接酶平端連接

AGCT

TCGAAluⅠDNA連接酶AGCTAGCTTCGATCGA重組體的轉化受體細胞轉JM109感受態(tài)含氨芐平板Am重組質(zhì)粒感受態(tài)原核細胞的轉化（細菌轉化）1)受體細胞的選擇限制缺陷型:避免修飾和降解重組缺陷型：避免重組整合轉化親和型：較高的可轉化性遺傳互補型：利于篩選感染缺陷型：防止感染2）轉化方法CaCl2誘導轉化電穿孔PEG介導轉化人工體外包裝特殊處理受體細胞細胞膜特性改變CaCl2處理受體細菌50-100mmol/LCaCl2

感受態(tài)細菌重組體轉入細菌基因重組轉染體外包裝噬菌體噬菌體體外包裝3）轉化率：轉化細胞/細胞總數(shù)影響因素：

載體：載體性質(zhì)、空間結構、分子大小等受體細胞轉化過程含氨芐平板連接目的基因基因載體連接酶轉化重組體克隆的篩選與鑒定篩宿主細胞轉化后的克隆群體：1遺傳檢測法1）抗藥性標志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板2）標志補救（?-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段X-galLacZ藍色化合物X-gal（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶2電泳檢測法凝膠電泳檢測加樣孔DNAMarker空質(zhì)粒重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒酶切重組質(zhì)粒的PCR擴增片段原位雜交3菌落雜交篩選法4免疫化學檢測法放射性抗體檢測法濾膜（固定抗體）+5DNA序列檢測ACTGAAGGCT外源基因在宿主細胞中的表達重組子目的基因的mRNA表達蛋白質(zhì)大腸桿菌（E.coli）受體細胞表1E.coli表達體系優(yōu)勢：

一種成熟的基因克隆表達的受體細胞繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制易于進行遺傳操作和高效表達不足之處：1）缺乏適當?shù)霓D錄后和翻譯后加工機制。2）缺乏表達蛋白質(zhì)復性系統(tǒng)，表達蛋白無特異性空間結構。3）表達產(chǎn)物不穩(wěn)定，易被細菌蛋白酶降解。2目的基因在E.coli中的高效表達三個因素：

強化蛋白質(zhì)的生物合成抑制蛋白質(zhì)的降解恢復蛋白質(zhì)的空間構象3目的基因表達產(chǎn)物的檢測1）蛋白質(zhì)的PAGE對照樣品Marker2）表達蛋白生物學功能檢測淀粉酶基因表達4目的蛋白的分離純化分子篩親和柱離子交換抗原抗體目的蛋白基因載體目的基因

質(zhì)粒噬菌體病毒PCRcDNA人工合成基因文庫限制性內(nèi)切酶有切口的載體有切口的目的基因DNA連接酶

重組體

轉化