環(huán)境微生物學(xué)微生物的生長與代謝-2課件

環(huán)境微生物學(xué)第3章微生物的生長與代謝第三節(jié)環(huán)境微生物的生長繁殖微生物純培養(yǎng)技術(shù)微生物的生長繁殖

(1)分離

(2)培養(yǎng)(3)純培養(yǎng)的保存與復(fù)壯二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)純培養(yǎng)基本步驟：(2)培養(yǎng)(1)分離無菌技術(shù)

分離、純化技術(shù)從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，必須隨時(shí)注意保持微生物純培養(yǎng)物的“純潔”，防止其他微生物的混入。在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)物時(shí)防止其被其他微生物污染的技術(shù)被稱為無菌技術(shù)，它是保證微生物學(xué)研究正常進(jìn)行的關(guān)鍵。接種操作用接種環(huán)或接種針分離微生物，或在無菌條件下把微生物由一個(gè)培養(yǎng)器皿轉(zhuǎn)接到另一個(gè)培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)，是微生物學(xué)研究中最常用的基本操作。由于打開器皿就可能引起器皿內(nèi)部被環(huán)境中的其他微生物污染，因此微生物實(shí)驗(yàn)的所有操作均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，其要點(diǎn)是在火焰附近進(jìn)行熟練的無菌操作，或在無菌箱或操作室內(nèi)無菌的環(huán)境下進(jìn)行操作。所謂平板，即培養(yǎng)平板(cultureplate)的簡稱，它是指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛有固體培養(yǎng)基的平皿。固體培養(yǎng)方法可將單個(gè)微生物分離和固定在固體培養(yǎng)基表面或里面。固體培養(yǎng)基(用瓊脂或其他凝膠物質(zhì)固化的培養(yǎng)基)，可使每個(gè)孤立的活微生物體生長、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分離、培養(yǎng)微生物的固體培養(yǎng)基是瓊脂固體培養(yǎng)基平板。Koch建立的平板分離微生物純培養(yǎng)的技術(shù)簡便易行，100多年來一直是各種菌種分離的最常用手段。稀釋倒平板法涂布平板法平板劃線分離法單細(xì)胞挑取法純培養(yǎng)方法二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)1、稀釋平板分離法：傾注平板法和涂布平板法?；具^程：（1）梯度稀釋過程；（2）分離培養(yǎng)過程涂布傾注梯度稀釋過程10-110-210-310-410-510-64)操作要點(diǎn)：

無菌操作稀釋平板分離法使用過程中的幾個(gè)問題1)梯度稀釋度的確定：需分離微生物在樣品中的數(shù)量2)選擇菌落接種的依據(jù)：a、菌落特征；b、菌體的特征3)微生物純培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)：菌落特征一致性2.涂布平板法

在微生物學(xué)研究中更常用的純種分離方法是涂布平板法。其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒人無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)3.平板劃線分離法

用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板表面得到單菌落。二、微生物純培養(yǎng)技術(shù)平板劃線分離法（StreakPlate）特點(diǎn)：快速、方便。

分區(qū)劃線（適用于濃度較大的樣品）

連續(xù)劃線（適用于濃度較小的樣品）單細(xì)胞(單孢子)分離

采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)，稱為單細(xì)胞(單孢子)分離法。單細(xì)胞分離法的難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動(dòng)物較容易，個(gè)體很小的細(xì)菌則較難。單細(xì)胞分離法對(duì)操作技術(shù)有比較高的要求，多限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究中采用。

三、目標(biāo)微生物純培養(yǎng)篩選的基本思路１、待分離樣品的確定２、培養(yǎng)基的選擇３、純化過程環(huán)境條件的控制（溫度、空氣、PＨ、抑制劑）（Ｐ１３８－１４１）傳代培養(yǎng)保藏常用的有瓊脂斜面、半固體瓊脂柱及液體培養(yǎng)等。選擇使用適宜的培養(yǎng)基，并在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行移種。傳代培養(yǎng)十分繁瑣，容易污染，特別是會(huì)由于菌株的自發(fā)突變而導(dǎo)致菌種衰退，使菌株的形態(tài)、生理特性、代謝物的產(chǎn)量等發(fā)生變化。（二）純培養(yǎng)的衰退與復(fù)壯四、純培養(yǎng)的保存與復(fù)壯衰退的原因：衰老、變異衰退的表現(xiàn)：生長緩慢優(yōu)良性狀的喪失抗逆性下降衰退的預(yù)防：控制繼代頻率創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件采取有效的保存方式復(fù)壯狹義（被動(dòng)）廣義（主動(dòng)）復(fù)壯方法：選優(yōu)汰劣微生物生長的指標(biāo)(生物量的測(cè)定)細(xì)胞群體數(shù)量的增加細(xì)胞群體總重量增加從群體水平上衡量(間接的測(cè)定方法)微生物的生長繁殖

細(xì)菌的個(gè)體生長

細(xì)菌的群體生長繁殖微生物生長繁殖

微生物生長是細(xì)胞物質(zhì)有規(guī)律地、不可逆增加，導(dǎo)致細(xì)胞體積擴(kuò)大的生物學(xué)過程，這是個(gè)體生長的定義。繁殖是微生物生長到一定階段，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)制與重建并通過特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過程。在一定時(shí)間和條件下細(xì)胞數(shù)量的增加，這是微生物群體生長的定義。細(xì)菌的個(gè)體生長細(xì)菌的個(gè)體生長包括細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)制與再生、細(xì)胞的分裂與控制：染色體DNA的復(fù)制和分離細(xì)胞壁擴(kuò)增細(xì)菌的分裂細(xì)菌的群體生長繁殖

細(xì)菌接種到均勻的液體培養(yǎng)基后，在不補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)或移去培養(yǎng)物，保持整個(gè)培養(yǎng)液體積不變條件下，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌數(shù)為縱坐標(biāo)，根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間里細(xì)菌數(shù)量的變化，可以作出一條反映細(xì)菌在整個(gè)培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線，這種曲線稱為生長曲線。一、微生物生長量的測(cè)定微生物生長量的測(cè)定微生物數(shù)量的測(cè)定顯微鏡直接計(jì)數(shù)法稀釋平板計(jì)數(shù)法最大概率法比濁法稱重法含N量測(cè)定法DNA含量測(cè)定法ATP含量測(cè)定法代謝活性法微生物重量的測(cè)定(一)微生物數(shù)量的測(cè)定1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法使用細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，計(jì)數(shù)直觀。一、微生物生長量的測(cè)定直接計(jì)數(shù)

這類方法是利用特定的細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。此法的缺點(diǎn)不能區(qū)分死菌與活菌。

每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)

＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×l000×稀釋倍數(shù)(一)微生物數(shù)量的測(cè)定2、稀釋平板計(jì)數(shù)法對(duì)樣品稀釋培養(yǎng)，據(jù)形成的菌落數(shù)計(jì)數(shù)。優(yōu)點(diǎn)：傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法。對(duì)設(shè)備要求不高。一、微生物生長量的測(cè)定10-310-510-410-6

此法又稱活菌計(jì)數(shù)法，其原理是每個(gè)活細(xì)菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。

每毫升原菌液活菌數(shù)＝

同一稀釋度三個(gè)以上重復(fù)平皿菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)3.平板菌落計(jì)數(shù)法★技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15~20min完成操作），嚴(yán)格無菌操作；★注意事項(xiàng)：每一支吸管只能用于一個(gè)稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度；★適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養(yǎng)瓊脂上生長的微生物，★誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當(dāng)操作(一)微生物數(shù)量的測(cè)定３、比濁計(jì)數(shù)法根據(jù)細(xì)菌懸浮液的吸光度測(cè)定其數(shù)量。優(yōu)點(diǎn)：簡便，直接。一、微生物生長量的測(cè)定(二)微生物重量的測(cè)定1、稱重法用離心或過濾的方法將菌體從培養(yǎng)基中分離、冼凈，稱濕重或干重。優(yōu)點(diǎn)：簡單可靠。一、微生物生長量的測(cè)定在活性污泥法中采用的指標(biāo)：（1）混合液懸浮固體(MLSS)（粗放測(cè)定）污泥—干燥----稱重(W1)（2）揮發(fā)性懸浮固體(MLVSS)（相對(duì)準(zhǔn)確）上述已稱重污泥-----馬福爐(500度2小時(shí))----冷卻---稱重(W2)(二)微生物重量的測(cè)定2、含氮量測(cè)定法

根據(jù)樣品中菌體蛋白質(zhì)含量計(jì)算微生物重量的方法。

一、微生物生長量的測(cè)定原理：（1）微生物蛋白質(zhì)含量穩(wěn)定（2）氮是蛋白質(zhì)的穩(wěn)定成分(蛋白質(zhì)量=6.25×總含N量)優(yōu)點(diǎn)：測(cè)定準(zhǔn)確。二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律分批培養(yǎng)：將少量的細(xì)菌接種到一定體積的液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)，最后一次性收獲的過程。生長曲線：細(xì)菌在新的適宜的環(huán)境中生長、繁殖、衰老、死亡的動(dòng)態(tài)變化。㏒細(xì)胞數(shù)

延滯期指數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期單細(xì)胞微生物的典型生長曲線二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律根據(jù)細(xì)菌生長繁殖速率將生長曲線分四個(gè)階段：滯留適應(yīng)期二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律特點(diǎn)：分裂遲緩、代謝活躍。產(chǎn)生原因：（2）細(xì)胞分裂必需因子的缺乏（1）接種時(shí)的機(jī)械損傷引延遲期（滯留適應(yīng)期）延遲期（滯留適應(yīng)期）4、菌株的遺傳性滯留適應(yīng)期二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律研究滯留適期長短的意義？影響延遲期長短的因素：1、培養(yǎng)基成分2、接種物菌齡3、接種量對(duì)數(shù)期（指數(shù)生長期）特點(diǎn)：（1）代謝活性強(qiáng)（2）世代時(shí)短而穩(wěn)定對(duì)數(shù)生長期二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律對(duì)數(shù)期（指數(shù)生長期）對(duì)數(shù)生長期二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律見教材P93Nt=2nN0n=3.33(lgNt-lgN0)G=t/n=0.301t/(lgNt-lgN0)

n——繁殖代數(shù)G——世代時(shí)(每繁殖一代所需的時(shí)間)N0——對(duì)數(shù)生長期開始微生物數(shù)量Nt——對(duì)數(shù)生長期經(jīng)過時(shí)間t后微生物數(shù)量穩(wěn)定期（最高生長量期）最高生長量期特點(diǎn)：1、細(xì)菌數(shù)量增加率為0。2、部分細(xì)菌大量積累代謝產(chǎn)物。細(xì)菌數(shù)量增加率為0的原因?二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律衰亡期特點(diǎn)：菌體活性降低、大量死亡；細(xì)胞畸變、自溶革蘭氏染色不穩(wěn)定衰亡期二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律什么時(shí)期菌體代謝產(chǎn)物最多什么時(shí)期細(xì)菌細(xì)胞代謝活性最強(qiáng)什么時(shí)候細(xì)菌細(xì)胞總數(shù)最多什么時(shí)期細(xì)菌細(xì)胞生長速度最快什么時(shí)期世代時(shí)間短而穩(wěn)定對(duì)數(shù)生長期最高生長量最高生長量對(duì)數(shù)生長期對(duì)數(shù)生長期小結(jié)二、細(xì)菌分批培養(yǎng)群體生長規(guī)律二、連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）分批培養(yǎng)（batchculture）：將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入。不再補(bǔ)充和更換，最后一次性收獲。連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）：在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長時(shí)間地處于對(duì)數(shù)生長期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。原理：當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達(dá)到對(duì)數(shù)期后期時(shí)，一方面以一定的速度流進(jìn)新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，其中的微生物就能長期保持對(duì)數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。單批培養(yǎng)恒濁法恒化法單批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng) 時(shí)間連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液lg細(xì)胞數(shù)（個(gè)/ml）連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)原理二、連續(xù)培養(yǎng)以一定流速輸入新鮮培養(yǎng)液并流出培養(yǎng)物，確保流出的老菌數(shù)等于新增殖數(shù)，使培養(yǎng)保持對(duì)數(shù)生長的過程。優(yōu)點(diǎn)：一定生理狀態(tài)實(shí)驗(yàn)材料提高工業(yè)生產(chǎn)效益保持細(xì)菌培養(yǎng)液濁度恒濁培養(yǎng)二、連續(xù)培養(yǎng)保持細(xì)菌培養(yǎng)液營養(yǎng)物質(zhì)濃度恒化培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒化連續(xù)培養(yǎng)概念：以恒定流速使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細(xì)菌生長速率恒定的方法。原理：通過控制某一種營養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、生長因子等），使其始終成為生長限制因子，而達(dá)到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進(jìn)行生長繁殖。特點(diǎn)：維持營養(yǎng)成分的亞適量，控制微生物生長速率。菌體生長速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。應(yīng)用范圍：實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究恒化器Chemostat或bactogen

概念：通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。原理：通過調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入的速度和培養(yǎng)物流出的速度來維持菌濃度不變,即濁度不變。主要采