水體及土壤樣品中類固醇激素的高效檢測方法,分析化學(xué)論文

水體及土壤樣品中類固醇激素的高效檢測方法,分析化學(xué)論文類固醇激素是一類由膽固醇衍生而來的具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的物質(zhì)。環(huán)境中類固醇激素的主要來源包括人及脊椎動物的排泄、人工合成含類固醇激素藥物的使用以及醫(yī)院或制藥廠廢水的排放[1-4].人類來源的類固醇激素主要通過污水處理廠處理后排入水體，動物來源的類固醇激素主要通過糞便排泄進(jìn)入環(huán)境體[5-7].由于這類物質(zhì)具有較強(qiáng)的生物活性，一旦進(jìn)入水體就可能對非目的生物正常的內(nèi)分泌功能產(chǎn)生干擾。有報道表示清楚，長期暴露在低濃度的類固醇激素下會對魚類的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面影響并導(dǎo)致雌性特征在雄性魚中出現(xiàn)[8-9].類固醇激素在環(huán)境介質(zhì)中殘留的準(zhǔn)確測定是對其進(jìn)行風(fēng)險評價和污染防治的基礎(chǔ)。當(dāng)前類固醇激素的分析有氣相色譜法、液相色譜法和酶聯(lián)免疫分析法等[10-12].由于類固醇激素在環(huán)境中的濃度通常較低，通常需要對樣品進(jìn)行富集。當(dāng)前主要采用的富集方式方法包括固相萃取〔SPE〕和固相微萃取法〔SPME〕[13-14].對于土壤及沉積物等固體樣品中類固醇激素的測定還需通過溶劑提取。超聲提取〔USE〕，加速溶劑提取〔ASE〕都有運(yùn)用[15-16].本文采樣丹磺酰衍生化的方式方法提高類固醇激素的電離效率并結(jié)合固相萃取和加速溶劑萃取技術(shù)，建立了水體及土壤樣品中類固醇激素準(zhǔn)確、靈敏的檢測方式方法。1材料和方式方法1.1儀器與試劑Varian1200LLC-MS/MS電噴霧〔ESI〕三重四級桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀〔Varian公司，美國〕。Di-onexASE200加速溶劑萃取系統(tǒng)〔Dionex公司，美國〕。NovaPackC18〔1504.6mm,4m〕色譜柱〔Waters公司〕。ENVI-18〔6mL,500mg〕和LC-18〔3mL,500mg〕固相萃取小柱〔Supelco公司〕。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)孕酮〔progesterone〕，醋酸美倫孕酮〔melengestrolacetate〕，雌酚酮〔estrone〕，17-雌二醇〔17-estradiol〕，17-雌二醇〔17-estradiol〕，雌三醇〔estriol〕和17乙炔雌二醇〔17-ethinylestra-diol〕購于Sigma公司。內(nèi)標(biāo)物質(zhì)氘代17-雌二醇〔17-estradiol-D3〕和氘代雌三醇〔estriol-D2〕購于C/D/NIsotopes公司。分析純藥品和色譜純有機(jī)溶劑均購于Fisher公司。1.2樣品采集地表水樣品采自天然河道，用1L玻璃瓶保存，回實(shí)驗室后過0.7m玻璃纖維濾膜并在4℃儲藏。表層土壤〔0~20cm〕樣品采自一植物園內(nèi)，冷凍枯燥后過篩〔0.2cm〕并在-20℃儲藏。1.3樣品前處理水樣用固相萃取方法富集。固相萃取小柱〔ENVI-18〕先后用6mL丙酮和去離子水活化。取過濾后的水樣200mL,調(diào)節(jié)pH值到7,參加40L濃度為500g/L的內(nèi)標(biāo)后過固相萃取小柱，流速約為10mL/min.隨后用含20%丙酮的水溶液清洗。最后用6mL丙酮洗脫。洗脫液用高純氮?dú)獯蹈刹⑦M(jìn)行衍生化。土壤樣品用加速溶劑萃取法萃取。取過篩的土壤樣品5g,參加50L濃度為500g/L的內(nèi)標(biāo)，同硅藻土混合后裝入11mL萃取管，兩頭用玻璃纖維濾膜密封。優(yōu)化的萃取條件為：丙酮，溫度60℃，壓力1500psi,預(yù)熱5min,加熱5min,淋洗體積60%,吹掃時間2min,循環(huán)2次。萃取液稀釋到200mL,然固相萃取方式方法進(jìn)行凈化和富集，方式方法同水樣。1.4衍生化用100L碳酸氫鈉溶液〔0.1mol并用NaOH調(diào)節(jié)pH值至10.5〕溶解氮?dú)獯蹈傻臉悠罚瑓⒓?00L丹磺酰氯〔1mg/L溶解于丙酮〕。震蕩混合后置于60℃烘箱內(nèi)，加熱3min.取出樣品，氮?dú)獯蹈刹⒂?.4mL甲醇溶解，轉(zhuǎn)移到2mL樣品瓶，儲藏于-20℃待分析。1.5儀器分析色譜分析條件為：流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，流量0.3mL/min.洗脫梯度為：0~5min,流動相B由40%升至73%,5~25min,升至78%,25~27min升至100%,保持5min后降到40%并平衡6min.定量采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法。質(zhì)譜為正離子形式，枯燥氣體溫度300℃，屏蔽電壓150V,針電壓6000V,碰撞氣體壓力2.0mTorr.其他參數(shù)設(shè)置見表1.2結(jié)果與討論2.1固相萃取經(jīng)過優(yōu)化水體中類固醇激素的提取，我們比擬了兩種反相固相萃取小柱〔ENVI-18和LC-18〕的效率。反相吸附劑能夠從水體中吸附非極性的物質(zhì)而對極性物質(zhì)的吸附能力較弱。本文所研究的目的物質(zhì)均為弱酸〔pKa10〕，水體的pH值可能會影響固相萃取對目的物質(zhì)吸附的效率。因而，我們比照了pH值為3和7時兩種反相固相萃取小柱的回收率。結(jié)果顯示兩種固相萃取小柱在pH值為3和7時均能獲得80%的回收率〔圖1〕。兩種小柱和不同pH值的萃取效率無顯著性差異。結(jié)果表示清楚所研究類固醇激素極性較弱，即便在中性條件下仍以分子形式存在?？紤]到酸性條件會增加水體中酸性物質(zhì)的吸附，進(jìn)而增加樣品中基質(zhì)含量[17],因而選取pH值為7作為固相萃取條件。除此之外，LC-18小柱在萃取經(jīng)過中較易堵塞，進(jìn)而降低流速，所以選擇ENVI-18小柱進(jìn)行進(jìn)一步研究。2.2溶液清洗優(yōu)化在用LC-MS/MS分析時，化合物的電離效率極易遭到樣品中基質(zhì)的影響[18].為了減小基質(zhì)效應(yīng)，我們試圖用一定比例的丙酮水溶液清洗固相萃取小柱。結(jié)果顯示當(dāng)丙酮含量不超過20%時不會對目的物質(zhì)的回收率產(chǎn)生顯著影響〔圖2〕。因而，選擇用含20%丙酮的水溶液清洗固相萃取小柱來凈化樣品。2.3加速溶劑萃取優(yōu)化土壤中類固醇激素的分析需要先將目的物質(zhì)從土壤中萃取出來。加速溶劑萃取技術(shù)是利用高溫高壓條件提高萃取效率。本文研究了不同溶劑和溫度對萃取回收率的影響。結(jié)果表示清楚丙酮比甲醇具有更好的萃取效率〔圖3〕。高溫條件通常能夠提高萃取效率，但目的物質(zhì)的回收率在100℃的回收率反而低于60℃。這可能是由于高溫時，更多基質(zhì)被引入樣品，增加了基質(zhì)的影響，可以能是在高溫條件下，目的物質(zhì)發(fā)生降解。根據(jù)結(jié)果，選擇丙酮為萃取溶劑，60℃為萃取溫度進(jìn)行試驗。2.4衍生化經(jīng)過優(yōu)化所選類固醇激素極性較弱，導(dǎo)致這些物質(zhì)在ESILC-MS/MS分析經(jīng)過中電離效率較低進(jìn)而影響到檢測的靈敏度[19].通過丹磺酰衍生化反響引入極性基團(tuán)能夠大大提高電離效率進(jìn)而提高檢測的靈敏度。孕酮和醋酸美倫孕酮不具有活性基團(tuán)，不發(fā)生反響。其他類固醇激素中的活性羥基中的氫被丹磺?；〈?。本文研究了衍生化試劑的用量以及類固醇激素的濃度對衍生化效果的影響。結(jié)果表示清楚衍生化使得類固醇激素在儀器上的響應(yīng)提高5~10倍〔圖4〕。當(dāng)類固醇激素的濃度低于100g/L時，100L衍生化試劑的效果略好于200L衍生化試劑的效果。但當(dāng)類固醇激素的濃度到達(dá)200g/L時，200L衍生化試劑的效果較好。這可能是由于在較低濃度時，100L和200L衍生化試劑均能到達(dá)較高的衍生化效率，但200L衍生化試劑會引入更多的雜質(zhì)進(jìn)而影響信號的強(qiáng)度。但在高濃度時，100L衍生化試劑的衍生化效率可能不完全?？紤]到環(huán)境中類固醇激素的殘留濃度通常在ng/L量級，濃縮后也在幾個到幾十個g/L量級，因而選取100L衍生化試劑進(jìn)行衍生化。2.5線性關(guān)系和方式方法檢出限將標(biāo)準(zhǔn)品逐級稀釋配置成濃度為1,5,10,50,100,200,500g/L的溶液。在優(yōu)化的條件下進(jìn)行測定。通過對測得結(jié)果進(jìn)行線性擬合，相關(guān)系數(shù)〔r2〕優(yōu)于0.998〔表2〕。講明在所測濃度范圍內(nèi)，儀器相應(yīng)與濃度呈線性關(guān)系。方式方法檢出限為能產(chǎn)生3倍信噪比〔s/n=3〕的最小樣品濃度。水體和土壤中目的物質(zhì)的方式方法檢出限分別為0.02~0.6ng/L和0.01~0.18ng/g〔表2〕。2.6準(zhǔn)確度和精致細(xì)密度根據(jù)優(yōu)化試驗條件，將已經(jīng)知道濃度的類固醇激素標(biāo)準(zhǔn)溶液參加200mL地表水樣品中，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，試驗重復(fù)三次。數(shù)據(jù)見表2,水體中平均回收率為77%~97%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%~6.0%.土壤中平均回收率為62%~119%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差〔RSD〕為0.8%~15.5%.試驗數(shù)據(jù)表示清楚該方式方法準(zhǔn)確度與精致細(xì)密度均較好。與以發(fā)表的類固醇激素分析方式方法相比[19-20],本方式方法具有較高的分析靈敏度。2.7空白和環(huán)境樣品分析環(huán)境水樣采自武漢市區(qū)及周邊的地表水體。土壤樣品采自接受畜禽糞便改進(jìn)的農(nóng)田表層土。用去離子水和來自植物園的表層土做空白。按本方式方法分析?？瞻字形礄z測出目的物質(zhì)。地表水樣品中除醋酸美倫孕酮和17-乙炔雌二醇外均被檢出，總類固醇激素的濃度范圍為5.8~42.5ng/L.土壤中檢出17-雌二醇，17-雌二醇和雌酚酮，其濃度范圍為0.2~2.8ng/g.3結(jié)論建立了水體及土壤中類固醇激素的液相色譜質(zhì)譜分析方式方法。通過丹磺酰氯衍生化大大提高了分析方式方法的靈敏度。樣品前處理經(jīng)過的優(yōu)化使得該方式方法具有較高的準(zhǔn)確度和精致細(xì)密度。該方式方法適用于環(huán)境水體及土壤中類固醇激素殘留的分析。以下為參考文獻(xiàn)[1]RichardsonSD,TernesTA.Wateranalysis:emergingcontaminantsandcurrentissues[J].AnalyticalChemistry,2005,77〔12〕：3807-3838.[2]YingGG,KookanaRS,RuYJ.Occurrenceandfateofhormonesteroidsintheenvironment[J].EnvironmentInterna-tional,2002,28〔6〕：545-551.[3]ServosMR,BennieDT,BurnisonBK,etal.Distributionofestrogens,17-estradiolandestrone,inCanadianmunici-p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