二、α-淀粉酶活力的測定2010(精)

生物技術(shù)專業(yè)系統(tǒng)試驗（四）

——酶（蛋白質(zhì)）工程試驗II二、α-淀粉酶活力的測定

--國家標(biāo)準(zhǔn)GB8275-20091.目的意義2.試驗原理3.試劑和溶液4.儀器和器材5.試驗方法6.試驗報告7.思索題1.目的意義淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷鍵及α-1，6糖苷鍵連結(jié)的高分子多糖，是人類和動物的主要食物，也是食品、發(fā)酵、釀造、醫(yī)藥、紡織工業(yè)的基本原料。淀粉酶(amylase)是能夠水解淀粉分子鏈中的α-1,4糖苷鍵，將淀粉鏈切斷成為短鏈糊精、少量麥芽糖和葡萄糖，是淀粉粘度快速下降的酶制劑。包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶。它們廣泛存在于動物界、植物和微生物界。除特殊的外，一般淀粉酶對于生的淀粉不起作用，只作用于糊化后的淀粉。不同來源的淀粉酶，性質(zhì)有所不同。其中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶。3DStructuralofanα-Amylaseα-淀粉酶是淀粉及以淀粉為材料的工業(yè)生產(chǎn)中最重要的一種水解酶，其最早的商業(yè)化應(yīng)用在1984年，作為治療消化紊亂的藥物幫助劑。α-淀粉酶對淀粉的分解作用是工業(yè)上利用淀粉的基礎(chǔ)，如紡織工業(yè)上的退漿；酶法糖化制造葡萄糖、麥芽糖；酶法制造酒精、料酒等。例如，生產(chǎn)葡萄糖須要葡萄糖淀粉酶，但僅有葡萄糖淀粉酶作用，不能液化淀粉溶液，葡萄糖的生成速度特殊慢。此時，α-淀粉酶的運(yùn)用就成為必要條件。α-淀粉酶的活性測定，在理論探討和實際應(yīng)用中具有重要的意義。通過本試驗，學(xué)習(xí)一種測定α-淀粉酶酶活力的方法，鞏固并嫻熟分光光度計的運(yùn)用方法。2.試驗原理α-淀粉酶能夠?qū)⒌矸鄯肿又械摩?1，4糖苷鍵隨機(jī)切成長短不一的短鏈糊精、少量麥芽糖和葡萄糖，而使淀粉對碘的呈藍(lán)色特性反應(yīng)漸漸消逝，呈現(xiàn)棕紅色，其顏色消逝的速度與酶活性有關(guān)，可以用來表示淀粉酶水解的程度，因而能購?fù)ㄟ^反應(yīng)后溶液的吸光度值衡量酶的活力。3.試劑和溶液3.1原碘液稱取2.2g碘和4.4g碘化鉀完全溶解后定容至100ml，儲存于棕色瓶中（老師準(zhǔn)備）。3.2稀碘液吸取原碘液2ml，加20g碘化鉀用水溶解并定容至500ml。3.3可溶性淀粉溶液稱取2.000g（精確到0.001g）可溶性淀粉于燒杯中，加適量蒸餾水調(diào)成漿糊狀物，邊攪拌邊加入沸水90ml，攪拌加熱至完全透亮冷卻后定容至100ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。3.4磷酸緩沖液（pH6.0）4.52g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）和0.8g檸檬酸（C6H8O7·H2O），定容至100ml。pH計校正后運(yùn)用。3.5鹽酸溶液（0.1M/L）100ml

4.儀器及器材4.1儀器電子天平2臺

恒溫水浴鍋每組1臺

分光光度計每組1臺記時器每組1臺3.2器材（每組）15ml大試管10支5ml移液管10支1ml移液管5支10ml移液管10支比色皿1套（4個）雙蒸水1瓶（50ml）洗瓶1個玻璃平皿1套50ml小廣口瓶（棕色）2個50ml容量瓶1個100ml容量瓶1個500ml試劑瓶2個100ml試劑瓶2個250ml三角瓶2個200ml燒杯2個500ml燒杯1個記號筆1支、吸耳球、稱量紙、藥勺、試管架、研缽、紗布5.試驗方法

—GB8275-2009法將淀粉作為底物，通過比色法測定碘顯藍(lán)反應(yīng)色值的削減以測定α-淀粉酶活力的方法。5.1分析方法5.1.1待測酶液的制備精確稱取1g酶粉，用少量pH6.0磷酸緩沖液充分溶解，將上清當(dāng)心傾入容量瓶中，若有剩余殘渣，再加少量磷酸緩沖液充分研磨，最終樣品全部移入容量瓶中，用磷酸緩沖液定容至100ml，搖勻。四層紗布過濾，濾液放置于4℃冰箱待用。運(yùn)用前倍稀釋。5.1.2測定A液：吸取20ml可溶性淀粉溶液于試管中，加入磷酸緩沖液5ml，充分混勻后，置于60℃恒溫水浴中預(yù)熱5minB液：將1ml稀釋好的待測酶液加入A液，搖勻，立刻計時，精確反應(yīng)5minC液：將0.5ml0.1mol/L鹽酸和5ml稀碘液加入試管中，搖勻待用立刻用移液器吸取1mlB液，加入預(yù)先盛有C液的試管中，搖勻同時設(shè)置空白組（以1ml磷酸緩沖液取代1ml稀釋酶液）于660nm波長下，用10mm比色皿快速測定其吸光度值（A）依據(jù)吸光度表C1，查得所測酶液的酶活力5.1.3計算酶活力

X=c×n其中：X—樣品的酶活力，單位為u/gc—測試酶液的酶活力，單位為u/gn—樣品的稀釋倍數(shù)5.3留意事項酶反應(yīng)時間應(yīng)精確計算。試劑加入按規(guī)定依次進(jìn)行。6.試驗報告

酶活(u/g)1