演示文稿第三章第三節(jié)再生植株

（優(yōu)選）第三章第三節(jié)再生植株第一頁，共一百三十七頁。再生植株途徑懸浮培養(yǎng)途徑脫毒苗快繁育種材料快繁良種、突變體、種質(zhì)、瀕危材料快繁外植體體細胞雜交材料快繁融合原生質(zhì)體各種器官組織花藥、胚、胚胎、胚乳等脫毒處理目的愈傷組織叢生芽胚狀體原球莖壯苗生根移栽檢測脫毒苗檢測倍性檢測目的細胞生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)種質(zhì)保存成分檢測、提取等愈傷組織脫分化再分化人工種子第二頁，共一百三十七頁。再生植株途徑

常規(guī)快速繁殖基本環(huán)節(jié)脫毒苗組織培養(yǎng)育種培養(yǎng)細胞融合第三頁，共一百三十七頁。第一部分常規(guī)快速繁殖基本環(huán)節(jié)外植體處理-----愈傷組織（脫分化）----叢生芽、胚狀體、原球莖（再分化）----增值壯苗---根----移栽第四頁，共一百三十七頁。外植體

愈傷組織（脫分化培養(yǎng)基）叢生芽（再分化培養(yǎng)基）

再生根（生根培養(yǎng)基）再分化脫分化壯苗（壯苗培養(yǎng)基）

接種第五頁，共一百三十七頁。第六頁，共一百三十七頁。

接種材料修整方法

外植體類型修整方法根及地下部器官剪除老根、爛根；切除損傷及污染嚴重部位；用軟毛刷刷洗，去除泥土、蟲卵等附屬物；幼根剪或切成1至幾厘米長的根段。莖尖、莖段剪或切除枝條上的葉片、葉柄及刺、卷須等附屬物；軟質(zhì)枝條用軟毛刷蘸肥皂水刷洗、硬質(zhì)枝條用刀刮除枝條表面的蠟質(zhì)、油質(zhì)、茸毛等；枝條剪成帶2-3個莖節(jié)的莖段，長約4-5cm。一、外植體處理第七頁，共一百三十七頁。

接種材料修整方法

外植體類型修整方法葉片葉片帶油脂、蠟質(zhì)、茸毛，可用毛筆蘸肥皂水刷洗；較大葉片可剪成若干帶葉脈的葉塊，大小以能放入沖洗用容器即可。花器一般不用修整，直接沖洗消毒。果實、種子、胚、胚乳一般不用修整，直接沖洗消毒。種子、胚或胚乳培養(yǎng)時，對于種皮較硬的種子，可去除種皮或預(yù)先用低濃度的鹽酸浸泡或機械磨損。第八頁，共一百三十七頁。

接種材料修整與沖洗第九頁，共一百三十七頁。二、愈傷組織形成---脫分化植物細胞只要具有一個完整的膜系統(tǒng)和一個有生命力的核，即使是已經(jīng)高度成熟和分化，也還保持著回復(fù)到分生狀態(tài)的能力。一個細胞向分生狀態(tài)回復(fù)過程所能進行的程度，取決于它在原來所處的自然部位上已經(jīng)達到的細胞和生理狀態(tài)。第十頁，共一百三十七頁。1、愈傷組織特點植物細胞脫分化而不斷增殖形成的愈傷組織，主要由薄壁細胞構(gòu)成的非器官化組織或不定組織愈傷組織的顏色、質(zhì)地不同愈傷組織具有結(jié)構(gòu)的不均一性和生理和遺傳上的不穩(wěn)定性外植體產(chǎn)生的排列疏松而無規(guī)則且沒有發(fā)生分化的薄壁細胞。第十一頁，共一百三十七頁。2、愈傷組織形成的條件離體培養(yǎng)條件（尤其是激素的種類和濃度，常用的生長素是2，4－D，IAA和NAA，常用的細胞分裂素是KT和6－BA）外植體類型（木本植物中的幼態(tài)或成年態(tài)）外植體原來在植株上所處的位置（它反映了內(nèi)源激素的水平）第十二頁，共一百三十七頁。3、愈傷組織形成的過程誘導(dǎo)期誘導(dǎo)期是外植體細胞進行分裂準(zhǔn)備的時期。在這一時期外植體細胞大小沒有多大變化，但細胞內(nèi)合成代謝活躍，RNA含量迅速增加，細胞核體積明顯增大。分裂期細胞分裂的速度大大超過了細胞伸展的速率，細胞體積迅速變小，逐漸回復(fù)到分生狀態(tài)。外植體細胞由原來的靜止?fàn)顟B(tài)經(jīng)過誘導(dǎo)期的分裂準(zhǔn)備之后進入分裂高峰期，回復(fù)為分生狀態(tài)，這整個過程即為脫分化。脫分化細胞不斷進行分裂，從而形成了愈傷組織。第十三頁，共一百三十七頁。形成期形成期是外植體細胞經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期后形成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織的時期。進入形成期后，細胞的平均大小相對穩(wěn)定，不再減少，細胞分裂由原來局限在組織外緣的平周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部較深層局部細胞的分裂。分化期----愈傷組織增殖或形態(tài)發(fā)生：一方面：愈傷組織增殖---增殖型愈傷組織另一方面：形態(tài)發(fā)生期不定芽方式胚狀體方式---胚型愈傷組織第十四頁，共一百三十七頁。4、愈傷組織增殖將誘導(dǎo)形成的愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上時，愈傷組織就會進一步增殖生長，生長一段時間以后，又必須重新將愈傷組織切割成一定大小的愈傷組織塊，轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上繼續(xù)增殖。轉(zhuǎn)接必須及時，因為愈傷組織的生長基本符合s形生長曲線。第十五頁，共一百三十七頁。1）、無菌短枝型（微型扦插）2）、叢生芽發(fā)生型（器官型）3）、器官發(fā)生型4）、胚狀體型5）、原球莖型三、再生途徑與類型---愈傷組織再分化第十六頁，共一百三十七頁。外植體來源經(jīng)歷途徑再生類型莖段切割不定芽反復(fù)繼代分割外植體莖尖、莖段或初代培養(yǎng)的芽葉片、葉柄、花瓣等蘭科植物的莖尖或側(cè)芽幼枝生根誘導(dǎo)叢生芽生根頂芽側(cè)芽短枝完整

植株誘導(dǎo)愈傷組織不定芽不定根不定根體細胞經(jīng)歷類似合子胚的各個時期胚狀體原球莖反復(fù)繼代分化無菌短枝型叢生芽增殖型器官發(fā)生型胚狀體發(fā)生型原球莖發(fā)生型誘導(dǎo)

植株再生途徑第十七頁，共一百三十七頁。微型扦插頂芽CTK刺激帶芽的莖切段側(cè)芽接種培養(yǎng)形成的莖梢節(jié)長，直立向上呈小灌木叢狀獲得較多嫩莖梢莖段培養(yǎng)繼代擴繁試管苗生根培養(yǎng)無愈傷組織產(chǎn)生初代繼代1、無菌短枝型（微型扦插）第十八頁，共一百三十七頁。脫分化分化少量或無愈傷組織芽、芽叢切割芽叢繼代培養(yǎng)大量芽叢試管苗生根培養(yǎng)外植體初代繼代2、叢生芽發(fā)生型①②芽生芽第十九頁，共一百三十七頁。3、器官發(fā)生型第二十頁，共一百三十七頁。器官發(fā)生型有3種基本方式（順序）：先分化芽再分化根：待芽伸長后在其幼莖基部長根，形成完整的小植株，這種方式在木本植物組織培養(yǎng)中較為普遍，因此芽和根的誘導(dǎo)要分兩步完成先分化根再分化芽：先分化根再在根上產(chǎn)生不定芽而形成完整植株。一般來說，培養(yǎng)物若先形成根，則會抑制芽的形成愈傷組織的不同部位分別形成芽和根：然后二者的維管組織互相連接，成為具有統(tǒng)一的軸狀結(jié)構(gòu)的小植株第二十一頁，共一百三十七頁。①來源：體細胞②特點：直接成苗③發(fā)生：愈傷組織表面；懸浮培養(yǎng)的細胞或外植體表面4、胚狀體型第二十二頁，共一百三十七頁。體細胞胚(somaticembryo)或胚狀體(embryoid)：指的是在植物組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細胞、經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。定義表明:它不同于合子胚，因為它不是兩性細胞融合的產(chǎn)物;它不同于孤雌胚或孤雄胚，因為它不是無融合生殖的產(chǎn)物;它不同于組織培養(yǎng)中通過器官發(fā)生途徑形成的莖芽和根，因為它的形成經(jīng)歷與合子胚相似的發(fā)育過程，而且成熟的胚狀體是一個雙極性結(jié)構(gòu)。第二十三頁，共一百三十七頁。胚狀體苗與器官發(fā)生苗的區(qū)別胚狀體苗器官發(fā)生苗1.最初形成多來自單個細胞，雙向極性，兩個分生中心，較早分化出莖端和根端(方向相反)1.最初形成多來自多細胞，單向極性，單個分生中心2.胚狀體維管組織與外植體維管組織不相連2.不定芽和不定根與愈傷組織的維管組織相連3.具有典型的胚胎形態(tài)發(fā)生過程3.無胚胎形態(tài)，分生中心直接分化器官4.形成的幼苗具有子葉4.不定芽的苗無子葉5.胚狀體發(fā)育的苗，根和芽齊全，不經(jīng)歷誘導(dǎo)生根階段5.一般先長芽后誘導(dǎo)生根，或先長根后長芽第二十四頁，共一百三十七頁。第二十五頁，共一百三十七頁。體細胞胚的應(yīng)用……人工種子人工種子:將細胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的體細胞胚或具有發(fā)育成完整植株的分生組織（相當(dāng)于胚）包裹在一層含有營養(yǎng)物質(zhì)的膠囊（相當(dāng)于胚乳）里，再在膠囊外包上一層具有保護功能的外膜（相當(dāng)于種皮），形成在適宜條件下能夠發(fā)育成完整植株的人造顆粒，在外形上象石榴。結(jié)構(gòu)：體細胞胚、人工胚乳、人工種皮第二十六頁，共一百三十七頁。（海藻酸鈣凝膠）（云杉）第二十七頁，共一百三十七頁。優(yōu)點：

·其一，可使在自然條件下不結(jié)實或種子昂貴的植物得以繁殖，如三倍體、非整倍體、基因工程植物；

其二，固定雜種優(yōu)勢；其三，節(jié)省制種用地，且不受季節(jié)限制，可以實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，同時還避免了種子攜帶病原菌的危險；第二十八頁，共一百三十七頁。·其四，與利用試管苗相比，可以避免移栽困難，且可以實現(xiàn)機械化操作，同時還便于儲藏和運輸。其五，用人工種子播種可以節(jié)約糧食。例如，一個12L的發(fā)酵罐在20d內(nèi)生產(chǎn)的胡蘿卜胚狀體，可以制成1000萬粒人工種子，供幾千公頃農(nóng)田的種植需要，與天然種子相比，大大節(jié)約了糧食。第二十九頁，共一百三十七頁。人工種子利用中的問題（1）貯藏問題；（2）體細胞無性系變異；（3）成本問題。第三十頁，共一百三十七頁。短縮的、呈珠粒狀的、由胚性細胞組成的、類似嫩莖的器官。5、原球莖發(fā)生型第三十一頁，共一百三十七頁。初代培養(yǎng)中易出現(xiàn)的問題及對策污染操作污染分為細菌污染和真菌污染外植體自身帶菌導(dǎo)致的污染由于表面滅菌不徹底或外植體內(nèi)部帶菌所致

褐變褐變的概念及影響因素褐變的防止方法第三十二頁，共一百三十七頁。細菌污染細菌污染表現(xiàn)：在培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基表面或材料表面出現(xiàn)黏液狀物體、菌落或渾濁的水跡狀，有時甚至出現(xiàn)泡沫發(fā)酵狀。原因：主要是由于工作人員使用未經(jīng)充分消毒的工具、或由于呼吸排除的細菌、或操作人員用手接觸材料或器皿的邊緣，使微生物落入培養(yǎng)基中，有時也會因剪取某一帶菌材料后用具又未徹底滅菌，造成繼續(xù)污染。第三十三頁，共一百三十七頁。真菌污染真菌污染表現(xiàn)：在培養(yǎng)過程中，一般3—5天發(fā)現(xiàn)菌絲，既而很快出現(xiàn)灰、白、黃、綠等孢子。原因：空氣污染以及取放瓶塞揚起的灰塵和真菌孢子落入器皿中造成。第三十四頁，共一百三十七頁。褐變的概念及影響因素概念褐變是指培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料逐漸變褐而死亡的現(xiàn)象。褐化的發(fā)生是由于組織中多酚氧化酶被激活，酚類化合物被氧化形成褐色的醌類物質(zhì)。醌類化合物在酪氨酸酶的作用下，與培養(yǎng)材料組織中蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，引起其它酶系統(tǒng)失活，導(dǎo)致代謝紊亂，生長受阻。影響因素基因型材料的生理狀態(tài)培養(yǎng)基成分培養(yǎng)時間第三十五頁，共一百三十七頁。褐變的防止方法選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w，掌握適宜的采芽時間外植體用流水沖洗30分鐘以上，在接種前將外植體在無菌水中浸泡處理降低對外植體的切割損傷，或在無菌水中切割降低培養(yǎng)基中無機鹽濃度；缺省生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可減少酮類物質(zhì)分泌和氧化使用液體培養(yǎng)基可以迅速稀釋外植體傷口處分泌出的有毒物質(zhì)在培養(yǎng)基中加入活性炭在培養(yǎng)基中加入聚乙烯吡咯烷酮PVP加入抗氧化劑如檸檬酸、維生素C、L－半胱氨酸、硫脲在培養(yǎng)基中添加氨基酸(谷酰胺、精氨酸、天冬酰胺)、芳香甙、硫代硫酸鈉連續(xù)轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上有時可緩慢阻止色素的形成由苗芽基部光激活引起的褐化可通過將苗芽基部處于黑暗狀態(tài)得以消除控制光溫條件，避免過高第三十六頁，共一百三十七頁。四、試管苗的增殖和繼代培養(yǎng)第三十七頁，共一百三十七頁。試管苗的增殖和繼代培養(yǎng)植物材料在容器中培養(yǎng)一段時間后，往往需要轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上去生長。因為：培養(yǎng)基消耗盡植物材料在培養(yǎng)容器中已占盡生長空間需進一步增殖(轉(zhuǎn)到同樣配方的培養(yǎng)基上)植物材料轉(zhuǎn)入下一階段生長或另一種器官分化(轉(zhuǎn)到不同配方的培養(yǎng)基上)由于無機鹽和瓊脂濃度過高而導(dǎo)致培養(yǎng)基干化由于pH值下降而引起培養(yǎng)基流體化防止褐化現(xiàn)象發(fā)生而轉(zhuǎn)接適應(yīng)生根培養(yǎng)第三十八頁，共一百三十七頁。繼代培養(yǎng)中易出現(xiàn)的問題再生能力的下降玻璃化現(xiàn)象馴化作用第三十九頁，共一百三十七頁。試管苗繼代培養(yǎng)過程中分化再生能力衰退

原因：1、愈傷組織培養(yǎng)逐漸喪失了成器官中心；2、內(nèi)源激素的減少；3、染色體畸變。

解決措施：增加外源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)；篩選具有形態(tài)分生能力細胞團；縮短繼代時間；重新建立細胞系。第四十頁，共一百三十七頁。玻璃化現(xiàn)象玻璃化現(xiàn)象(vitrification)是一種異常的生理現(xiàn)象。玻璃化苗是植物組織培養(yǎng)時出現(xiàn)的半透明狀、畸形的試管苗。其解剖特點為：整株植物矮小腫脹，呈半透明狀。有時發(fā)育出大量短而粗的莖，節(jié)間很短或幾乎沒有節(jié)間。輸導(dǎo)組織雖可看到，但導(dǎo)管和管胞木質(zhì)化不完全。葉片厚而狹長，有時基部較寬。葉片皺縮或縱向卷曲，脆弱易折碎。葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)或蠟質(zhì)發(fā)育不完全，無功能性氣孔器。玻璃化葉片不具有柵欄組織，僅有海綿組織。第四十一頁，共一百三十七頁。玻璃化現(xiàn)象玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的原因一般而言，培養(yǎng)條件與玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生有關(guān).培養(yǎng)條件引起試管苗碳水化合物、氮代謝和水分狀態(tài)等發(fā)生生理異常。降低和減輕玻璃化現(xiàn)象采取的措施增加瓊脂和(或)糖濃度改善培養(yǎng)容器的氣體交換改變培養(yǎng)基的大量鹽類降低BA水平增強光照，適當(dāng)降低溫度避免采用容易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象的瓊脂種類采用液固兩相培養(yǎng)基第四十二頁，共一百三十七頁。玻璃化苗發(fā)生的機理

試管苗玻璃化的產(chǎn)生是由于內(nèi)源激素乙烯在代謝調(diào)節(jié)中所起的關(guān)鍵性啟動作用。試管苗在脅迫培養(yǎng)環(huán)境中，如水勢不當(dāng)，通氣不暢、生長調(diào)節(jié)劑濃度過高、溫度過高等，導(dǎo)致乙烯產(chǎn)生。培養(yǎng)瓶空氣中過剩的乙烯抑制了試管苗體內(nèi)乙烯的生物合成，但誘發(fā)了其它激素質(zhì)和量的改變及酶類的變化；另外，培養(yǎng)瓶中氣體組成的改變，也影響磷酸戊糖途徑、光呼吸途徑的進行。第四十三頁，共一百三十七頁。馴化作用馴化作用是指原先依賴于某種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)而生長的培養(yǎng)物，經(jīng)過一段時間的繼代培養(yǎng)后，不再需要這種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，即變成對該生長調(diào)節(jié)物質(zhì)自養(yǎng)的培養(yǎng)物的現(xiàn)象馴化作用一般并非是永久性變化，有時培養(yǎng)條件變化也會逆轉(zhuǎn)馴化作用，所以馴化作用是外遺傳變化。馴化作用可在繼代培養(yǎng)中自然發(fā)生，也可人為地改變培養(yǎng)條件，可以誘導(dǎo)或逆轉(zhuǎn)這種馴化作用。馴化作用可能是由于植物組織內(nèi)對該生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成增加所致，也可能是降解速率降低或受到保護所致，組織對生長調(diào)節(jié)物質(zhì)敏感性降低也可能是一種原因，也不排除上述幾個原因共同作用的結(jié)果。第四十四頁，共一百三十七頁。五、壯苗與生根

壯苗材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流，使太細弱的材料達到壯苗的目的生根（離體生根和活體生根）第四十五頁，共一百三十七頁。離體生根壯苗后的單苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后即可生根。一般來說，多數(shù)植物的生根只需要一次培養(yǎng)，但有少部分植物的生根必須經(jīng)過多次培養(yǎng)才能達到目的。一般認為礦物元素濃度較高時有利于發(fā)展莖葉，而較低時有利于生根，所以多采用1/2或1/4量的MS培養(yǎng)基，全部去掉或僅用很低的細胞分裂素，并加入適當(dāng)?shù)纳L素。第四十六頁，共一百三十七頁。活體生根又稱試管外生根：芽苗先在生長素中快速浸蘸或在含有相對高濃度生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5－10天，然后在溫室中栽入培養(yǎng)基質(zhì)中，并輔以高濕度環(huán)境，即經(jīng)常噴霧，幾天后，芽苗可自行生根。第四十七頁，共一百三十七頁。六、馴化移栽第四十八頁，共一百三十七頁。試管苗的特點1、根與輸導(dǎo)系統(tǒng)不通；2、在高濕、弱光和異養(yǎng)條件下分化和生長的葉，葉表保護組織不發(fā)達甚至完全沒有，易于失水萎焉。試管苗葉光合作用能力極低。3、組織幼嫩、結(jié)構(gòu)較松散、細胞含水率高，機械組織不發(fā)達，容易發(fā)生機械損傷，對病蟲害特別敏感第四十九頁，共一百三十七頁。試管苗生態(tài)環(huán)境與自然環(huán)境的差異高溫且恒溫高濕弱光無菌不恒溫高濕強光有菌第五十頁，共一百三十七頁?；静襟E：煉苗（訓(xùn)化）-----移栽---移栽后管理第五十一頁，共一百三十七頁。（一）、試管苗的馴化目的：提高試管苗的適應(yīng)性，促其健壯，最終提高移栽成活率原則：★從溫、光、濕度及有無雜菌等環(huán)境因素考慮?！锺Z化開始數(shù)天內(nèi)，與培養(yǎng)環(huán)境條件相似；后期與預(yù)計栽培條件相似，逐步適應(yīng)。方法：即煉苗。不開口自然光下2-3天，然后開口1-2天。第五十二頁，共一百三十七頁。1、瓶煉：試管苗在移植前必須對其進行高光強鍛煉，同時將瓶口包扎物打開，使試管苗慢慢適應(yīng)外界環(huán)境，讓植株生長粗壯，增強小苗體質(zhì)以提高移苗成活率，這個過程叫做馴化或煉苗。

關(guān)鍵技術(shù)：1）生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)的天數(shù)；2）生根的狀態(tài)；3）煉苗時的光照強度；4）煉苗的時間；5）瓶苗開口也有技巧可言第五十三頁，共一百三十七頁。2、盤煉：從瓶中小心取出試管苗，在20度左右的溫水中浸泡約10min，換水兩次，將粘附于試管苗根部的培養(yǎng)基清洗干凈，迅速栽在裝有已經(jīng)過消毒處理的基質(zhì)的育苗盤中，噴淋透水，噴灑一定劑量的殺菌藥，然后放在干凈、排水良好的溫室或塑料保溫棚中，保持較高的空氣濕度，煉苗20天左右。

關(guān)鍵技術(shù)：1）取苗時手要輕。如果培養(yǎng)基太干燥，可以先用清水浸泡一段時間；2）煉苗基質(zhì)以疏松、排水性和透氣性良好者為宜，且必須經(jīng)過消毒處理；3）植苗入盤的時間，最好選在無風(fēng)陰濕的天氣；4）對于剛進行盤煉的小苗，要特別注意掌握光照；5）盤煉進行一周后，應(yīng)該適當(dāng)葉面追肥。第五十四頁，共一百三十七頁。（二）、移栽1、大田移栽2、容器移栽第五十五頁，共一百三十七頁。試管苗的移栽移栽方法：取出試管苗，全部輕洗去培養(yǎng)基栽入基質(zhì)(事先澆透水)后，栽后輕澆薄水，移入高濕環(huán)境(90%以上)。移栽場所與設(shè)施：日光溫室塑料大棚馴化室軟塑料缽、育苗盤、苗床。移栽時期：選擇自然出苗期移栽基質(zhì)：要求透氣、保濕、保肥，易滅菌。可選用珍珠巖、蛭石、沙子；外加草炭、腐殖土。配比：①珍珠巖：蛭石：草炭或腐殖土=1：1：0.5；②沙子：草炭或腐殖土=1：1第五十六頁，共一百三十七頁。組培馴化常用基質(zhì)第五十七頁，共一百三十七頁?！艋|(zhì)配比：珍：蛭：草(腐殖土)=1：1：0.5珍：草(腐殖土)=1：1注意基質(zhì)配比并保持適當(dāng)?shù)耐庑缘谖迨隧摚惨话偃唔?。◆保持基質(zhì)通氣性：選顆粒狀基質(zhì)，澆水勿多。▼第五十九頁，共一百三十七頁。爐渣預(yù)處理、做畦與裝填基質(zhì)第六十頁，共一百三十七頁?；|(zhì)裝填后狀態(tài)與澆水第六十一頁，共一百三十七頁。第六十二頁，共一百三十七頁。試管苗的移栽方法Ⅰ第六十三頁，共一百三十七頁。試管苗的移栽方法Ⅱ第六十四頁，共一百三十七頁。第六十五頁，共一百三十七頁。（三）、試管苗移栽后的管理1、保持小苗的水份供需平衡；2、控制溫度；3、控制光照；4、菌類控制。

第六十六頁，共一百三十七頁。保持小苗水分供需平衡1周內(nèi)：

環(huán)境高濕。1周后：小苗生長后逐漸降濕，拱棚兩端通風(fēng)。半個月后：

揭膜，控水。第六十七頁，共一百三十七頁。防止菌類滋生◆基質(zhì)高壓滅菌或3h烘烤滅菌或太陽能滅菌?！暨m當(dāng)使用殺菌劑、消毒劑?！粢圃詴r少傷苗?！魢娝?.1%尿素或1/2MS大量元素液追肥，加快苗生長。第六十八頁，共一百三十七頁。溫光條件適宜適宜生根溫度：18－20℃，溫度低可加地?zé)峋€。移栽初期弱光，后逐漸加強光照，過渡到自然光照。第六十九頁，共一百三十七頁。提高試管苗質(zhì)量及時出瓶馴化，避免試管苗老化改善環(huán)境條件，減少蒸騰，防止葉片灼傷選擇適宜的基質(zhì)防止菌類滋生保持試管苗水分供需平衡加強肥水管理和病蟲害防治提高試管苗馴化移栽成活率的措施第七十頁，共一百三十七頁。第七十一頁，共一百三十七頁。第二部分脫毒苗組織培養(yǎng)脫毒處理+常規(guī)快速繁殖環(huán)節(jié)+檢測第七十二頁，共一百三十七頁。脫毒苗的獲取及繁育技術(shù)概述脫毒材料的獲取病毒的檢測規(guī)程無毒體系的保持

第七十三頁，共一百三十七頁。概述近年來，隨著我國觀賞花卉種植面積和栽培種類的不斷提高，病毒的發(fā)生與危害也逐年加重，病毒病已上升成為影響觀賞花卉質(zhì)量、產(chǎn)量的主要病害受病毒侵染的觀賞花卉有可能會表現(xiàn)為花葉、碎色、褪綠、黃化等癥狀。然而，很多病毒可能不表現(xiàn)任何可見癥狀，但受害的植株長勢下降，品質(zhì)退化，產(chǎn)量、抗逆性下降目前獲得無毒種苗常用方法主要是采用莖尖培養(yǎng)、熱處理、藥劑處理等脫毒技術(shù)來消除營養(yǎng)體中的病源，并由這些組織再生出完整的植株，作為原原種國內(nèi)外常用于病毒檢測鑒定方法包括生物學(xué)(如鑒別寄主)、血清學(xué)(如ELISA)、分子生物學(xué)(如PCR)三類本章重點討論脫毒材料的獲取、花卉病毒的檢測規(guī)程、無毒體系的保持等三方面的內(nèi)容第七十四頁，共一百三十七頁。脫毒材料的獲取熱處理脫毒莖尖脫毒抗病毒藥劑處理脫毒影響莖尖脫毒的因素

第七十五頁，共一百三十七頁。脫毒方式：熱處理脫毒→病毒鈍化(寄主植物很少或不會受到傷害)

溫湯浸漬處理：在50℃左右的溫水中浸漬

10分鐘至數(shù)小時。缺點：易使材料受傷。

熱空氣處理：35-40℃，幾十分鐘，長可達數(shù)月溫?zé)嶂委熓遥ㄏ洌﹥?nèi)。可采用變溫處理，即晝夜或隔日高低溫交替處理的方法，以提高脫毒成功率缺點：缺陷是并非能脫除所有病毒。熱處理時間過長，會造成植株代謝紊亂，影響成活率，加大了品種變異的可能性。熱處理需與其他方法配合應(yīng)用才可獲得良好的效果。第七十六頁，共一百三十七頁。生長點（約0.1-1MM區(qū)域）幾乎不含或含病毒很少.莖尖培養(yǎng)脫毒第七十七頁，共一百三十七頁。莖尖脫毒：分生組織中不含病毒可能跟以下幾點有關(guān)代謝活性高病毒的增殖依賴于寄主的代謝，由于分生組織具有很高的代謝活性，病毒無法控制寄主的代謝機制無維管組織病毒是通過維管組織在寄主的組織中進行快速擴散的，由于分生組織中無細胞分化，那些存在于韌皮部的病毒(如PLRV)就不可能侵染分生組織，而侵染非韌皮部病毒也只能通過胞間連絲進行細胞間傳播，但它的速度很慢，難以侵染快速分裂的莖尖細胞高激素濃度植物的分生組織比其他組織的植物激素濃度高，可以抑制病毒的增殖第七十八頁，共一百三十七頁。影響莖尖脫毒的因素培養(yǎng)基選擇正確培養(yǎng)基，可以顯著提高獲得完整植株的成功率莖尖剝離體的大小在最適培養(yǎng)基條件下，莖尖剝離體的大小對其存活率的影響較大。一般被剝?nèi)〉那o尖越大，越容易產(chǎn)生再生植株。但植株莖尖的脫毒效率與其大小呈負相關(guān)，因此被剝?nèi)〉那o尖應(yīng)該小到足以能夠脫除病毒，但又能夠發(fā)育成為一個完整的植株第七十九頁，共一百三十七頁。培養(yǎng)條件莖尖的生理狀態(tài)莖尖最好要從活躍生長的芽上切取取芽的時間第八十頁，共一百三十七頁。其他途徑脫毒

愈傷組織培養(yǎng)脫毒

僅有部分單個細胞含有病毒——病毒的復(fù)制速度趕不上細胞的增殖速度或有些細胞通過突變獲得了抗病毒的抗性。缺陷——植株遺傳性不穩(wěn)定，可能會產(chǎn)生變異植株，并且一些作物的愈傷組織尚不能產(chǎn)生再生植株。

抗病毒藥劑處理脫毒：尖培養(yǎng)結(jié)合抗病毒劑處理，是觀賞花卉脫毒種苗規(guī)模化生產(chǎn)的較好選擇第八十一頁，共一百三十七頁。脫毒效果檢測抗血清(antiserum)鑒定：已知植物病毒——核蛋白（抗原）制備抗體；抗血清+未知的病毒植物→可見的沉淀（試管）酶聯(lián)免疫吸收鑒定（ELISA）：已知植物病毒（抗原）+一抗（已制備）——二抗（酶）——酶的顯色底物溶液——酶標(biāo)儀檢測電子顯微鏡（electricmicroscope)檢查法：直接觀察病毒的有無或種類指示植物法(indicatingplant)：被鑒定植物的汁液接種指示植物或嫁接接種法（指示植物作為砧木，被鑒定植物作接穗）第八十二頁，共一百三十七頁。無毒體系的保持原原種的無毒保持原原種的保持與擴繁可通過組培方式也可通過栽培方式進行原種的無毒保持采穗圃的無毒保持無毒優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)程序

第八十三頁，共一百三十七頁。原原種的無毒保持通過栽培方式進行應(yīng)注意防蟲溫室單盆定植器具消毒清潔衛(wèi)生定期噴藥病毒檢測第八十四頁，共一百三十七頁。原種的無毒保持原種在保持條件上，與原原種基本相同(如仍需防蟲溫室、基質(zhì)滅菌、器具消毒、清潔衛(wèi)生、定期藥劑防除等)仍有不同之處單系種植病毒抽測注：原種的繁殖不能無限制地進行，否則會造成植株退化，生活力下降第八十五頁，共一百三十七頁。采穗圃的無毒保持采穗圃是整個無毒體系的主體之一，也是實現(xiàn)商品價值的重要環(huán)節(jié)離地栽培適當(dāng)稀植母本植株更新與基質(zhì)消毒定期噴藥病毒抽測第八十六頁，共一百三十七頁。第三部分育種培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)：外植體+常規(guī)培養(yǎng)+倍性檢測-----單倍體培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)：胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)----克服遠緣雜交的不親和性細胞融合及融合細胞培養(yǎng)第八十七頁，共一百三十七頁。（一）、花藥及花粉培養(yǎng)1、概念與意義花藥培養(yǎng)：花藥培養(yǎng)是把花粉發(fā)育到一定階段的花藥接種到培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育程序，使其分裂形成細胞團，進而分化成胚狀體，產(chǎn)生再生植株，或形成愈傷組織，由愈傷組織再分化成植株。第八十八頁，共一百三十七頁。第八十九頁，共一百三十七頁。1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)花藥培養(yǎng)的基本程序是：

外植體選擇－外植體(花蕾)預(yù)處理—外植體消毒—剝?nèi)』ㄋ帯臃N—誘導(dǎo)培養(yǎng)—分化培養(yǎng)第九十頁，共一百三十七頁?；ㄋ幣囵B(yǎng)前給予一定的低溫處理是十分必要的。

煙草、茄子3～5℃72小時

水稻10℃10～14天

柑橘3℃5～10天

馬鈴薯4℃48小時低溫處理的作用：

可以激發(fā)花粉母細胞產(chǎn)生兩個相等核:一個營養(yǎng)核一個生殖核；

保持高比例的強生活力花粉，同時延緩體細胞組織的衰老；

激發(fā)花粉產(chǎn)生原胚；

促使細胞同步分裂。1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)第九十一頁，共一百三十七頁。花藥培養(yǎng)中單倍體形成的途徑營養(yǎng)細胞發(fā)育途徑:生殖核退化,營養(yǎng)核發(fā)育生殖細胞發(fā)育途徑:營養(yǎng)核退化，生殖核發(fā)育營養(yǎng)細胞和生殖細胞同時發(fā)育的途徑:花粉均等分裂途徑:

1.4.2花藥及

花粉培養(yǎng)第九十二頁，共一百三十七頁。花粉及小孢子培養(yǎng):花粉培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來，以單個花粉粒作為外植體進行離體培養(yǎng)的技術(shù)。由于花粉已是單倍體細胞，誘發(fā)它經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的植株都是單倍體植株?；ǚ叟囵B(yǎng)的基本程序是：

取材時期的確定－外植體(花蕾)預(yù)處理—外植體消毒—花粉或小孢子的分離—接種—培養(yǎng)取材時期的確定四分體—單核早期—單核晚期—雙核早期—雙核晚期—三核期預(yù)處理有利于改變正常的發(fā)育途徑，而且還可以促進花粉植株的形成第九十三頁，共一百三十七頁?；ǚ刍蛐℃咦拥姆蛛x:花藥→小燒杯(有基本培養(yǎng)基)→擠壓花藥(注射器內(nèi)管)花粉釋放→過濾(尼龍篩)→低速離心（100-160r/min)→吸管吸掉碎片→加入新鮮培養(yǎng)基→連續(xù)進行兩次過濾，到每毫升含103-104個花粉/mL

培養(yǎng)方法

花藥看護培養(yǎng)

花粉懸浮培養(yǎng)（微室培養(yǎng)）

第九十四頁，共一百三十七頁。單倍體植株的鑒定與二倍化鑒定方法：形態(tài)學(xué)鑒定染色體分析單倍體植株的二倍化：秋水仙素處理加倍第九十五頁，共一百三十七頁。優(yōu)點：不受花藥的藥隔，藥壁、花絲等體細胞的干擾；缺點是較比花粉培養(yǎng)難度大。為何更多的要花藥培養(yǎng)?(藥壁提供激素)共同的目的：花粉細胞→單倍體(haploid)細胞→單倍體植株（但不是最終目的但具應(yīng)用潛力，為什么？）→經(jīng)染色體加倍→正常結(jié)實二倍體植株。第九十六頁，共一百三十七頁。單倍體植物三個明顯的特點：

體細胞染色體數(shù)減半；

生長發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減??；

雌雄配子嚴重敗育，有的甚至不能進入有性世代。加倍后的二倍體特點：屬于真正的純系。和常規(guī)多代自交純化方法相比，可節(jié)省大量的時間和勞力。

第九十七頁，共一百三十七頁。單倍體植株的二倍體化試管小苗期間用0.2—0.4%秋水仙溶液浸泡處理24—48小時；用同樣濃度的秋水仙素溶液處理已移栽土壤的單倍體植株的生長錐利用組織培養(yǎng)過程中，植物細胞易于自發(fā)加倍的特點，培養(yǎng)從單倍體植物上切取的外植體，誘導(dǎo)形成愈傷組織后再使之分化，通?？傻玫胶芨弑壤亩扼w。第九十八頁，共一百三十七頁。（二）、植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)包括胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)。1、植物胚培養(yǎng)(embryocultureofplants)克服雜交育種中雜種胚的早期夭折胚培養(yǎng)包括成熟胚(matureembryo)培養(yǎng)；幼胚(immatureembryo)培養(yǎng)第九十九頁，共一百三十七頁。2、子房培養(yǎng)子房培養(yǎng)包括授粉前和授粉后的子房培養(yǎng)。材料的選擇品種間的差異胚囊發(fā)育時期與花粉發(fā)育時期的相關(guān)性（大麥）花粉發(fā)育時期胚囊發(fā)育時期

單核中期大孢子四分體

單核靠邊期單核至四核胚囊

二核花粉期八核胚囊

三核花粉期成熟胚囊

第一百頁，共一百三十七頁。3、胚乳培養(yǎng)胚乳細胞的全能性？被子植物與裸子植物胚乳（三倍體或單倍體？）（在離體培養(yǎng)條件下，胚乳細胞是否與其它體細胞和花粉一樣，具有全能性而再生植株。）大多數(shù)被子植物的胚乳是三倍體，能否通過胚乳培養(yǎng)獲得三倍體植株而得到無籽結(jié)實；通過胚乳培養(yǎng)技術(shù)，探索改良農(nóng)、林及園藝植物三倍體育種技術(shù)的可能性。到目前為止，已有40多種植物的胚乳進行了培養(yǎng)。其中蘋果、柚、橙、檀香、枸杞、獼猴桃、玉米、大麥、小黑麥、水稻、馬鈴薯、梨、核桃等的胚乳培養(yǎng)得到了再生植株。其它有的分化除芽、根、葉等或得到愈傷組織。第一百零一頁，共一百三十七頁。裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳為配子體的一部分，由大孢子直接分裂發(fā)育而成，因此它是單倍體組織。在被子植物中胚乳是雙受精的產(chǎn)物，在倍性上屬于三倍體，事實上我們培養(yǎng)胚乳的首要目的也是為了直接獲得三倍體植株。第一百零二頁，共一百三十七頁。幾個概念：什么是原生質(zhì)體：？原生質(zhì)體培養(yǎng)是將植物原生質(zhì)體在一定條件下培養(yǎng)，經(jīng)過細胞壁再生而形成細胞，再分裂成細胞團的過程。第四部分細胞融合第一百零三頁，共一百三十七頁。第一百零四頁，共一百三十七頁。植物原生質(zhì)體的特點（與植物細胞比）：仍然具細胞全能性吸收能力增強分泌能力增強穩(wěn)定性較差第一百零五頁，共一百三十七頁。原生質(zhì)體融合，即體細胞雜交。用人工的方法，把分離的不同品種或不同種的原生質(zhì)體誘導(dǎo)成融合細胞，再經(jīng)離體培養(yǎng)誘導(dǎo)分化和再生完整植株的整個過程。若取材為體細胞，則成為體細胞雜交。原生質(zhì)體制備和培養(yǎng)是原生質(zhì)體融合的先導(dǎo)技術(shù)第一百零六頁，共一百三十七頁。4.1基本程序：原生質(zhì)體制備（材料的選擇、酶的使用、滲透壓的調(diào)控、原生質(zhì)體的收集與純化、原生質(zhì)體活力的測定）→原生質(zhì)體融合（過程/方法：自發(fā)融合、誘導(dǎo)融合/方式：對稱融合、不對稱融合；自體融合、異體融合）→雜種細胞選擇→雜種細胞培養(yǎng)→由雜種組織再生植株→雜種或胞質(zhì)雜種植株的鑒定4.2細胞融合的意義第一百零七頁，共一百三十七頁。原生質(zhì)體制備：將旺盛生長的植物細胞懸浮在含滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中，加入適量的細胞壁水解酶，在一定條件下作用一段時間，使細胞壁破壞。除去細胞壁碎片、未作用的細胞等，即得。質(zhì)壁分離使相對穩(wěn)定復(fù)合酶（緩沖液+滲透壓穩(wěn)定劑+細胞膜保護劑+表面活性劑）材料差異25-30℃第一百零八頁，共一百三十七頁。取材與除菌取材與除菌取材與除菌酶解為何？分離洗滌鑒定P61后保存第一百零九頁，共一百三十七頁。融合的過程：三階段1、凝聚作用：因胞間連絲的作用，2個或2個以上的原生質(zhì)體質(zhì)膜彼此靠近2、連接“橋”的形成：質(zhì)膜緊密粘連，細胞質(zhì)間呈連續(xù)狀態(tài)。3、異核體或同核體的形成：細胞質(zhì)橋的擴展，融合完成。異體融合：不同種的雙親原生質(zhì)體發(fā)生融合——得到“異核體”自體融合：發(fā)生在同一個親本原生質(zhì)體之間的融合——得到“同核體”第一百一十頁，共一百三十七頁。一、融合方法：自發(fā)融合和誘導(dǎo)融合誘導(dǎo)融合的方法：1、物理方法——電融合法原理（1）交流電的作用——原生質(zhì)體靠近，串珠狀（2）直流電的作用——破壞細胞膜，使融合優(yōu)缺點：操作簡單，但設(shè)備昂貴第一百一十一頁，共一百三十七頁。具體操作：（1）加樣：融合培養(yǎng)基（葡萄糖15%+NaCl6%）2d+親本原生質(zhì)體懸浮液各1d——混合，放置10-20min（2）倒置觀察（3）通交流電1s（50Hz.30－40V）—放置10-20min（4）直流電（5）洗脫：洗脫液（CaCl2.2H2O2%+甘露醇5%）搖1h（6）離心（80×g）3-5min，去上清液（7）培養(yǎng)第一百一十二頁，共一百三十七頁。融合成功與否的影響因素（1）基因型--不同材料融合條件不同。（2）原生質(zhì)體的濃度—105/ml。大于105/ml，連珠長，易多核融合；小于105/ml，接觸疏松，不易融合。（3）親本混合的比例—與自體融合的難易有關(guān)AB自體融合難易接近，則1：1；如A更易自體融合，則A：B=1:5-10（4）交變電的強度：影響成串的速度和質(zhì)量。（5）直流高電壓脈沖：影響異質(zhì)融合率。第一百一十三頁，共一百三十七頁。2、PEG-高鈣高pH法：原理：PEG促形成異核體。高鈣離子是原生質(zhì)體間的聯(lián)系者，可促原生質(zhì)體間的粘合，使更易融合，且維持原生質(zhì)體與融合體的穩(wěn)定性，防破裂。高pH使質(zhì)膜表面特性發(fā)生改變從而促進融合。水溶性高分子化合物，可做蛋白質(zhì)的脫水和植物的水分脅迫實驗；PEG4000，6000，10000等；重復(fù)性好、對細胞無毒第一百一十四頁，共一百三十七頁。操作：試管中進行（1）加樣（2）低速離心：原生質(zhì)體聚集在一起（3）加2mL促融劑（甘氨酸-NaOH+CaCl2.2H2O+甘露醇＋PEG）37℃水浴10-30min（4）洗滌：甘露醇+CaCl2.2H2O，反復(fù)兩次（5）培養(yǎng)克服原生質(zhì)體之間的排斥作用第一百一十五頁，共一百三十七頁。影響因素：（1）原生質(zhì)體密度4%-5%（2）PEG種類和濃度：南瓜+黃瓜：PEG600025-35%的濃度；馬鈴薯栽培種+野生種：PEG400020-30%（3）Ca2+pH（4）融合液的滲透壓、保溫時間（5）培養(yǎng)時間第一百一十六頁，共一百三十七頁。二、融合方式：對稱融合：完整原生質(zhì)體的融合——核與核融合，細胞質(zhì)與細胞質(zhì)融合——形成對稱雜種，可發(fā)育成遺傳穩(wěn)定的異源雙二倍體。異源四倍體中,由于兩個種的染色體各具有兩套染色體數(shù)為雙親之和；外型：中間類型；自交可正常結(jié)實結(jié)果：導(dǎo)入有用基因的同時，也帶入了不利基因第一百一十七頁，共一百三十七頁。非對稱融合：利用某種外界因素x射線γ射線對親本之一的原生質(zhì)體選擇性地破壞其細胞核（A），由用碘乙酰胺等處理在細胞核中含優(yōu)良基因的另一種親本的原生質(zhì)體，選擇性地使細胞質(zhì)失活(B)，二者的原生質(zhì)體融合實現(xiàn)性狀的優(yōu)化組合——形成不對稱雜種染色體達不到雙親之和；外型呈中間型或偏一方；雄性器官退化，正?；ǚ哿Ｉ?，育性低第一百一十八頁，共一百三十七頁。對稱雜種：親本雙方原生質(zhì)體完全融合在一起，相互之間未發(fā)生排斥。不對稱雜種：親本雙方原生質(zhì)體部分融合或在融合體在分裂過程中一方的部分核或質(zhì)被排斥。第一百一十九頁，共一百三十七頁。雜種細胞選擇1、借助于精巧的顯微操作技術(shù)將融合體和雜種細胞直接挑選出來?？梢姌?biāo)記法：雙親及雜種的大小、顏色差異（大豆與煙草；荔枝和龍眼）；缺