濕熱滅菌工藝的微生物學(xué)驗(yàn)證

濕熱滅菌工藝的微生物學(xué)驗(yàn)證第一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日藥害事件與GMP的發(fā)展cGMP的誕生與發(fā)展藥害事件中的產(chǎn)品特點(diǎn)成分復(fù)雜對(duì)質(zhì)量要求高劣質(zhì)產(chǎn)品具有致命性患者在使用前無(wú)法確定藥品的質(zhì)量第二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日2案例分析（續(xù)）1972年，英國(guó)，德旺波特事故英國(guó)德旺波特醫(yī)院輸液滅菌過(guò)程不力而導(dǎo)致污染，造成至少5例敗血癥患者死亡的事故。消毒柜的排氣閥已被碎玻璃和紙團(tuán)堵塞，導(dǎo)致在滅菌時(shí)，消毒柜內(nèi)的空氣無(wú)法順利排出，局部空間達(dá)不到預(yù)定滅菌溫度溫度記錄儀損壞在取樣和檢測(cè)方法上存在失誤未按照書(shū)面規(guī)程操作滅菌釜設(shè)備維修保養(yǎng)存在缺陷第三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日3其它案例1907鼠疫疫苗破傷風(fēng)梭菌1943熒光素滴眼液銅綠假單胞菌1946免疫血清疫苗金色葡萄球菌1948滑石粉破傷風(fēng)梭菌1966抗生素眼藥膏銅綠假單胞菌1970洗必泰消毒劑洋蔥假單胞菌1972靜脈注射劑假單細(xì)菌、歐文菌、腸桿菌屬亞種1977隱形眼鏡護(hù)理水黏質(zhì)沙雷菌、腸道細(xì)菌屬亞種1981外科敷藥梭菌屬亞種第四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日4注射劑的特點(diǎn)藥效迅速，作用可靠可用于不宜口服給藥的患者，發(fā)揮局部定位作用注射給藥不方便，注射時(shí)有疼痛制造過(guò)程復(fù)雜，生產(chǎn)成本高直接入血制劑，質(zhì)量要求比其它劑型更嚴(yán)格，使用不當(dāng)更易發(fā)生危險(xiǎn)第五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日5注射劑的質(zhì)量要求無(wú)菌，成品中不得含有活的微生物無(wú)熱原澄明度，不得有肉眼可見(jiàn)的渾濁或異物安全性，不得引起對(duì)組織的刺激性或發(fā)生毒性反應(yīng)滲透壓、pH、必要的物理和化學(xué)穩(wěn)定性第六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日6無(wú)菌藥品生產(chǎn)管理要點(diǎn)防止微生物污染防止熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素的污染防止產(chǎn)品中有異物裝量準(zhǔn)確第七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日78無(wú)菌藥品的兩種生產(chǎn)方式最終滅菌工藝在高潔凈環(huán)境下進(jìn)行灌裝和密封通常，產(chǎn)品、容器和密封件的微生物污染水平很低在密封容器中進(jìn)行最終滅菌無(wú)菌生產(chǎn)工藝產(chǎn)品、容器和密封件分別進(jìn)行滅菌，然后進(jìn)行灌封在極高潔凈環(huán)境下進(jìn)行灌裝和密封產(chǎn)品在最終容器中不再做進(jìn)一步的滅菌處理對(duì)各個(gè)組成部分的滅菌工藝需要進(jìn)行嚴(yán)格驗(yàn)證和監(jiān)控在灌封前和灌封過(guò)程中的操作會(huì)帶來(lái)污染風(fēng)險(xiǎn)第八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日9兩種生產(chǎn)方式的比較無(wú)菌生產(chǎn)工藝的局限通常的無(wú)菌保證水平(10-3至10-6)影響因素多最終滅菌工藝的優(yōu)點(diǎn)賦予產(chǎn)品更高的無(wú)菌保證水平生產(chǎn)中可變因素少，出現(xiàn)偏差的概率低幾乎能殺滅產(chǎn)品中的所有微生物第九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日10歐盟要求(CPMP/QWP/054/9800)包材熱穩(wěn)定差不得成為采用無(wú)菌工藝的唯一理由。企業(yè)應(yīng)當(dāng)將選擇適用于某個(gè)處方的最佳滅菌方法放在首位，然后再考慮相應(yīng)的包裝材料。產(chǎn)品包材的選擇可能必須考慮許多其它因素…。此情況下，應(yīng)…在注冊(cè)申請(qǐng)資料中作出科學(xué)合理的解釋。…，如容器類(lèi)型、給藥途徑…（如某些眼科用藥），而該容器無(wú)法經(jīng)受最終熱力滅菌，…一般是可以接受的。…此條件下，企業(yè)有責(zé)任繼續(xù)尋找可接受的替代容器，以便盡早采用首選的最終滅菌法。由于最終滅菌具有最高的無(wú)菌保證水平，因此，不得因商業(yè)原因取消最終滅菌法。第十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日最終滅菌產(chǎn)品無(wú)菌保證的主要環(huán)節(jié)產(chǎn)品的無(wú)菌保證滅菌前微生物污染包裝密封性滅菌工藝滅菌設(shè)備滅菌工藝驗(yàn)證二次污染原料設(shè)備和生產(chǎn)過(guò)程生產(chǎn)環(huán)境生產(chǎn)時(shí)限第十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日11無(wú)菌工藝產(chǎn)品無(wú)菌保證的主要環(huán)節(jié)產(chǎn)品的無(wú)菌保證非無(wú)菌生產(chǎn)過(guò)程（控制微生物污染）包裝密封性設(shè)備材料藥液的滅菌原料設(shè)備和生產(chǎn)過(guò)程生產(chǎn)環(huán)境生產(chǎn)時(shí)限工藝設(shè)計(jì)＋人員防護(hù)操作模式環(huán)境監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)無(wú)菌生產(chǎn)工藝驗(yàn)證質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、微生物學(xué)檢驗(yàn)方法及驗(yàn)證、設(shè)備與工藝驗(yàn)證、環(huán)境監(jiān)測(cè)、工藝與過(guò)程控制、更衣、人員培訓(xùn)無(wú)菌生產(chǎn)過(guò)程(防止微生物污染)第十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日12滅菌工藝在無(wú)菌藥品生產(chǎn)中的應(yīng)用最終滅菌產(chǎn)品

灌裝在容器中的藥品必要時(shí)，產(chǎn)品溶液或粉末、內(nèi)包裝材料、設(shè)備、管路必要時(shí)，用具、人員防護(hù)裝備等無(wú)菌工藝產(chǎn)品

產(chǎn)品的組分、內(nèi)包裝材料和直接接觸設(shè)備

A級(jí)（或ISO5級(jí)）內(nèi)，任何接近產(chǎn)品的材料、人員防護(hù)裝備、用具等第十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日13滅菌的主要目的

殺滅或除去所有微生物繁殖體和芽胞最大限度地提高藥物制劑的安全性保護(hù)制劑的穩(wěn)定性保證制劑的臨床療效研究、選擇有效的滅菌方法，對(duì)保證產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義第十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日14經(jīng)典滅菌方法在制藥業(yè)中的應(yīng)用最終滅菌藥品濕熱滅菌法、干熱滅菌法、輻射滅菌法無(wú)菌工藝藥品除菌過(guò)濾法（如產(chǎn)品、工藝氣體等）濕熱滅菌法、干熱滅菌法輻照滅菌法（如防護(hù)裝備、濾器、一次性用具等）液體滅菌法（如某些生物制品、器械）氣體滅菌法（如防護(hù)裝備、濾器等）低溫蒸汽滅菌法（進(jìn)入隔離器的包裝材料等）第十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日15滅菌工藝的設(shè)計(jì)原則產(chǎn)品特定性滅菌工藝過(guò)度殺滅法滅菌工藝驗(yàn)證時(shí)和日常滅菌前微生物監(jiān)控所需要的信息量預(yù)計(jì)效期供熱量上升上升下降第十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日16滅菌工藝的設(shè)計(jì)原則Bioburden-basedprocess含菌量控制工藝StabilityStabilityStabilitySterilitySterilitySterilityOverkillprocess過(guò)度殺滅工藝相同溫度下時(shí)間遞增滅菌前含菌量和耐熱性監(jiān)控信息需求遞增（USP）Biologicalindicator/bioburdencombinedprocess生物指示劑/含菌量聯(lián)合控制工藝第十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日1718濕熱滅菌又稱(chēng)為Moistheatsterilizationunderpressure細(xì)胞內(nèi)起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)和酶發(fā)生熱變性或凝固。濕度對(duì)該破壞性過(guò)程起促進(jìn)作用。只要可能，通常取121℃（2個(gè)大氣壓）優(yōu)點(diǎn)：無(wú)殘留，不污染環(huán)境，不破壞產(chǎn)品表面，容易控制和重現(xiàn)性好包括脈動(dòng)真空滅菌器（或稱(chēng)預(yù)真空滅菌器）、蒸汽-空氣混合物滅菌器、過(guò)熱水滅菌器等第十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日濕熱滅菌國(guó)外法規(guī)和指南USPISO17665ISO11138-BI,ISO11140-CIHTM2010EN554,285PDATechnicalReportNo.1脈動(dòng)真空滅菌器示意圖第十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日19干熱滅菌原理：使微生物氧化而不是蛋白質(zhì)變性，因此溫度要高得多，時(shí)間也相應(yīng)延長(zhǎng)利用干熱滅菌工藝滅菌溫度高、時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)，可使干熱滅菌同時(shí)具備除熱原的功用。干熱滅菌適用于耐高溫但不適于濕熱或可被濕熱破壞的物品，如玻璃、金屬設(shè)備、器具，不需濕氣穿透的油脂類(lèi)，耐高溫的粉末化學(xué)藥品等干熱滅菌不適用于橡膠、塑料及大部分藥品。第二十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日20干熱滅菌國(guó)外法規(guī)和指南USPISO11138-BI,ISO11140-CIISO20857PDATechnicalReportNo.3PDATechnicalReportNo.7第二十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日21氣體滅菌滅菌劑的種類(lèi)環(huán)氧乙烷（ETO，C2H4O）臭氧（Ozone，O3）二氧化氯（ChlorineDioxide-ClO2）氣體滅菌不同于低溫蒸汽滅菌第二十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日22輻射滅菌輻射類(lèi)型α射線，穿透力差β射線，穿透力略強(qiáng)于α射線

γ射線，穿透力很強(qiáng)X射線，人工產(chǎn)生的電磁輻射電子束，可用于表面消毒（低能量）或內(nèi)部消毒（高能量）電離輻射殺滅微生物的作用，可以分為直接作用和間接作用兩種第二十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日23輻射滅菌國(guó)外法規(guī)和指南ISO11737PDATechnicalReportNo.11PDATechnicalReportNo.16第二十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日過(guò)濾除菌定義：除菌過(guò)濾是指除去流體中微生物的工藝過(guò)程，該過(guò)程不應(yīng)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。包括液體和氣體除菌過(guò)濾。藥品生產(chǎn)中采用的除菌過(guò)濾膜的孔徑一般不超過(guò)0.22um（或者0.2um，這兩種標(biāo)稱(chēng)沒(méi)有區(qū)別）除菌級(jí)過(guò)濾器可以有不同的大小、形式和膜材，過(guò)濾器的使用者應(yīng)當(dāng)根據(jù)使用需要選擇不同的過(guò)濾器。第二十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日25過(guò)濾除菌除菌級(jí)過(guò)濾器是指在工藝條件下每cm2

有效過(guò)濾面積可以截留107CFU的缺陷假單胞菌（Brevundimonasdiminuta,ATCC19146）的過(guò)濾器。影響細(xì)菌截留效果的因素過(guò)濾器源的因素，如過(guò)濾器類(lèi)型、結(jié)構(gòu)、基礎(chǔ)聚合物、表面改性化學(xué)、孔徑分布和過(guò)濾膜的厚度等工藝源的因素，如流體組分、流體性質(zhì)、工藝條件，產(chǎn)品、料液和生產(chǎn)環(huán)境中實(shí)際微生物污染的特點(diǎn)和水平等第二十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日26過(guò)濾除菌國(guó)外指南性文件PDATechnicalReportNo.15PDATechnicalReportNo.26PDATechnicalReportNo.40PDATechnicalReportNo.41第二十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日27低溫蒸汽滅菌氣體滅菌與低溫蒸汽滅菌的區(qū)別氣體滅菌穿透性好，分布均勻，不易受到溫濕度影響低溫蒸汽滅菌，兩個(gè)階段的濃度不同，條件不易控制來(lái)自PDASterilizationTechnology第二十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日28低溫蒸汽滅菌滅菌劑的種類(lèi)過(guò)氧化氫（HydrogenPeroxide，H2O2）過(guò)氧乙酸（PeraceticAcid-C2H4O3

）甲醛（Formaldehyde-CH2O）低溫蒸汽滅菌的特點(diǎn)室溫殘留，穿透性低，環(huán)境中的溫濕度會(huì)有差異，工藝的均一性不好第二十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日29基本概念無(wú)菌(Sterility)：是指產(chǎn)品中不存在任何活的微生物。這個(gè)絕對(duì)的概念，無(wú)法用實(shí)驗(yàn)來(lái)證明，不能成為工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)滅菌工藝(Sterilization)：通過(guò)適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)手段，將一定數(shù)量的活性微生物完全殺滅，并且使其生命活動(dòng)產(chǎn)生了不可逆轉(zhuǎn)的過(guò)程。最終滅菌是最常采用的工藝，新版GMP附錄已明確，不包括流通蒸汽滅菌無(wú)菌保證值（SAL）：指經(jīng)滅菌后非無(wú)菌品的概率。通常為10-6或10-3（來(lái)自ISO11139）第三十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日3031濕熱滅菌的能量轉(zhuǎn)移濕熱滅菌通常指一定壓力下的蒸汽滅菌，盡管有時(shí)也采用過(guò)熱水滅菌，如水浴式或噴淋式。蒸汽滅菌是一個(gè)高效的熱傳遞方式，因?yàn)檎羝佑|溫度較低的物體時(shí)，會(huì)釋放潛熱，生成冷凝水，直到物體溫度與蒸汽溫度相等。第三十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日32濕熱滅菌的熱力學(xué)基礎(chǔ)第三十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日濕熱滅菌工藝的無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)原則標(biāo)準(zhǔn)--定義通過(guò)物理/生物學(xué)方法證明，單位產(chǎn)品內(nèi)微生物存在的概率不得超過(guò)百萬(wàn)分之一，即批產(chǎn)品的污染概率不得超過(guò)百萬(wàn)分之一實(shí)際控制標(biāo)準(zhǔn)過(guò)度殺滅法（F0≥12）殘存概率法（F0≥8）Fo≥8最早在出現(xiàn)在USPXIXP709、BP1980A196中。不應(yīng)當(dāng)將Fo≥8簡(jiǎn)單地等同于無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)

第三十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日3334USP-過(guò)度殺滅標(biāo)準(zhǔn)示意USP過(guò)度殺滅法

每瓶100萬(wàn)個(gè)芽孢，其D=1

殺滅到100后，再使其存活概率下降6個(gè)對(duì)數(shù)單位

標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間Fo達(dá)12以上藥典無(wú)菌標(biāo)準(zhǔn)

生物負(fù)荷及其D值均可能不同，在將其殺滅到100后，法規(guī)要求再使其存活概率下降6個(gè)對(duì)數(shù)單位—可理解為安全系數(shù)。SALlgN6543210-1-2-3-4-5-6024681012第三十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日35濕熱滅菌中的微生物死亡模式實(shí)驗(yàn)表明，在恒定的滅菌溫度下，同一種微生物的死亡遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)規(guī)則，其死亡速率是微生物的耐熱參數(shù)D和殺滅時(shí)間的函數(shù)，與滅菌程序中微生物的數(shù)量無(wú)關(guān)?？捎孟旅娴陌雽?duì)數(shù)一級(jí)動(dòng)力模式表示：LgNF=LgN0

-F(T,z)/DT

[等式1]NF滅菌F分鐘后，微生物存活的數(shù)量F(T,z)滅菌程序在T℃和溫度系數(shù)z下的等效滅菌時(shí)間DT微生物在T℃下，下降一對(duì)數(shù)單位所需的時(shí)間。說(shuō)明：該特定溫度必須與F值計(jì)算中所采用的溫度相一致N0初始微生物的數(shù)量第三十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日36無(wú)菌檢查實(shí)驗(yàn)的局限性實(shí)驗(yàn)本身存在統(tǒng)計(jì)學(xué)局限性p,批產(chǎn)品的污染率；n，取樣量批檢驗(yàn)不合格的可能性=1-(1-p)n

取樣量實(shí)際污染率0.1151015100.010.090.400.660.80200.020.180.650.890.96500.050.340.920.991000.090.630.993000.260.953,0000.95第三十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日37濕熱滅菌工藝決策樹(shù)是熱不穩(wěn)定材料嗎？按產(chǎn)品特性設(shè)計(jì)法采用過(guò)度殺滅設(shè)計(jì)法被滅菌品的形式？需考慮抽真空？現(xiàn)抽真空滅菌器？脈動(dòng)真空程序重力置換程序否是多孔固體物品密封液體產(chǎn)品要過(guò)熱水或SAMSAM程序任何濕熱程序有無(wú)可不可可用過(guò)熱水程序？要不要需加壓?jiǎn)?？SAM：表示蒸汽及空氣的混合物不要第三十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日38藥典要求EP對(duì)過(guò)度殺滅法的工藝要求： 對(duì)溶液的滅菌條件至少為121oC×15分鐘；也可采用其它組合條件，但滅菌效果須與上述相等效。目標(biāo)：SAL=10-6或更低第三十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日39藥典要求EP對(duì)過(guò)度殺滅法的工藝要求： 對(duì)溶液的滅菌條件至少為121oC×15分鐘；也可采用其它組合條件，但滅菌效果須與上述相等效。目標(biāo)：SAL=10-6或更低USP對(duì)過(guò)度殺滅法的工藝要求： 對(duì)溶液的滅菌條件需達(dá)到12D，至少為12分鐘目標(biāo)：使D121=1分鐘，數(shù)量為106的微生物經(jīng)過(guò)滅菌后達(dá)到SAL=10-6。第三十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日40滅菌工藝的開(kāi)發(fā)與設(shè)計(jì)根據(jù)滅菌前帶菌量進(jìn)行設(shè)計(jì)（產(chǎn)品特性設(shè)計(jì)法）基于對(duì)滅菌前產(chǎn)品所含微生物的耐熱特性和數(shù)量以及產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性滅菌后產(chǎn)品的污染概率須小于10-6。過(guò)度殺滅法基于工藝程序能殺滅更加耐熱微生物，并且再加上一定的安全系數(shù)；理論上對(duì)生物指示劑孢子的殺滅能力達(dá)到10-12。將兩者相結(jié)合兼顧產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性和無(wú)菌要求。第四十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日41EMEA滅菌工藝決策樹(shù)（適用于液體制劑）能否耐受121℃×15分鐘的濕熱滅菌條件選擇121℃×15分鐘濕熱滅菌工藝是否能否耐受F0≥8的濕熱滅菌條件，以達(dá)到SAL≤10-6選擇F0≥8的濕熱滅菌工藝，以達(dá)到SAL≤10-6是否使用無(wú)菌過(guò)濾加無(wú)菌灌封方式是否能否經(jīng)可截留微生物的過(guò)濾器對(duì)藥液進(jìn)行除菌過(guò)濾對(duì)原料預(yù)先滅菌，進(jìn)行無(wú)菌配制和無(wú)菌灌封第四十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日42滅菌工藝/程序的驗(yàn)證確認(rèn)（IQ、OQ）滅菌設(shè)備的安裝、運(yùn)行符合設(shè)定的要求驗(yàn)證（PQ）產(chǎn)品滅菌程序的有效性和重現(xiàn)性評(píng)估滅菌過(guò)程中可能發(fā)生的各種變化給滅菌效果帶來(lái)的影響，產(chǎn)品是否能達(dá)到藥典規(guī)定的無(wú)菌保證水平第四十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日43滅菌設(shè)備的IQ/OQ檢查設(shè)備構(gòu)造、控制/監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、運(yùn)行系統(tǒng)、安全系統(tǒng)及所有零部件均與采購(gòu)技術(shù)要求（URS）相符；控制/監(jiān)測(cè)儀表的校驗(yàn)，包括程序控制器、溫度、壓力和時(shí)間控制設(shè)備，以及計(jì)時(shí)器、記錄測(cè)量?jī)x等；試車(chē)–空載熱分布試驗(yàn)（來(lái)自PDA技術(shù)報(bào)告草案）溫度探頭10-20支；探頭精確度±0.5℃;須有探頭與腔室原探頭并列放置;檢測(cè)報(bào)警和安全系統(tǒng)的可靠性;真空系統(tǒng)的可靠性(起的作用、保持時(shí)間等);滅菌溫度下，各點(diǎn)間最大溫差(腔室內(nèi))≤2℃；同一點(diǎn)的最大溫差≤

±1.0℃;重復(fù)試驗(yàn)至少3次以證明具有重現(xiàn)性。第四十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日44滅菌工藝的PQ每種裝載方式下的熱穿透試驗(yàn)證明特定滅菌程序殺滅微生物的均一性和有效性;證明滅菌程序的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性;證明滅菌程序?qū)Ρ粶缇锲返倪m用性。容器內(nèi)部產(chǎn)品的熱穿透試驗(yàn)證明在每種裝載方式下：各點(diǎn)溫度分布的均一性、滅菌結(jié)果的重現(xiàn)性;證明最冷點(diǎn)達(dá)到了設(shè)定效果。高中低第四十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日45PQ常用BI形式生物指示劑試驗(yàn)結(jié)果與熱穿透試驗(yàn)保持一致所有測(cè)試點(diǎn)均應(yīng)確保SAL不低于10-6試驗(yàn)次數(shù)足以符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求（至少重復(fù)3次試驗(yàn)，試樣數(shù)為10–20支/次）第四十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日46滅菌設(shè)備的性能確認(rèn)空載熱分布和滿(mǎn)載熱分布試驗(yàn)（供參考）溫度探頭10-20支；探頭精確度±0.5℃;必須有探頭與腔室原探頭并列放置;檢測(cè)報(bào)警和安全系統(tǒng)的可靠性;真空系統(tǒng)的可靠性(產(chǎn)生的效率、維持時(shí)間等);滅菌程序一般選擇121℃×20分鐘；針對(duì)蒸汽透過(guò)型物品，在滅菌恒溫段內(nèi)，所有探頭溫度都在平均溫度的±1.5℃以?xún)?nèi)；在任何時(shí)間各點(diǎn)最大溫差不超過(guò)2℃；實(shí)際滅菌時(shí)間控制在期望值的±1%以?xún)?nèi)；實(shí)際滅菌壓力控制在期望值的±1.6%以?xún)?nèi)；冷點(diǎn)位置固定;針對(duì)蒸汽不可透過(guò)型物品，在滅菌恒溫段內(nèi)，所有探頭溫度都在平均溫度的±1℃以?xún)?nèi)；在任何時(shí)間各點(diǎn)最大溫差不超過(guò)1.5℃；實(shí)際滅菌時(shí)間控制在期望值的±1%以?xún)?nèi)；其它各項(xiàng)性能指標(biāo)均一;重復(fù)試驗(yàn)至少3次以證明重現(xiàn)性.第四十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日47相關(guān)的術(shù)語(yǔ)無(wú)菌保證值（SAL）：指經(jīng)滅菌后非無(wú)菌品的概率。最終滅菌產(chǎn)品非無(wú)菌品的概率不超過(guò)百萬(wàn)分之一，即SAL≤10-6D值：在一定溫度下將微生物數(shù)量殺滅90%或下降一個(gè)對(duì)數(shù)單位所需要的時(shí)間（分鐘）FT：指T℃下的滅菌時(shí)間F0：指標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間。將121℃作為標(biāo)準(zhǔn)滅菌溫度，當(dāng)Z設(shè)定為10℃時(shí)，滅菌程序賦予被滅菌品121℃下的等效滅菌時(shí)間。第四十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日48相關(guān)的術(shù)語(yǔ)-續(xù)滅菌率（L，LethalRate）公式：L(Tref,z)=10(T-Tref)/zT被加熱的物體的實(shí)際溫度Tref參照溫度，通常取121℃z微生物的z值（可取10℃），指使微生物的D變更一個(gè)對(duì)數(shù)單位滅菌溫度所需調(diào)節(jié)的度數(shù)用121℃和z取10代入，得L=1，即一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)單位，其它溫度下，可代入計(jì)算L公式推導(dǎo)：詳見(jiàn)藥品生產(chǎn)管理規(guī)范與質(zhì)量保證（南京大學(xué)出版社1989年）附錄三：濕熱滅菌和無(wú)菌保證。第四十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日49計(jì)算公式從L的公式推導(dǎo)，可得：

Fo/FT=D121/DT=L

Fo=D121×(logN0-logNt)從滅菌率的公式，可求得不同溫度下的滅菌率（詳見(jiàn)下頁(yè)），當(dāng)?shù)陀?00℃時(shí)，L可忽略不計(jì)。F0=10(T－121)/Z

dt∫tnt0將介紹三個(gè)示例第四十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日50不同溫度和z值下的滅菌率T/(℃)Z＝7Z＝8Z＝9Z＝10Z＝11Z＝121000.0010.0020.0060.0080.0120.018…………………1150.1390.1780.2150.2510.2850.3161160.1930.2370.2780.3160.3510.3831170.2680.3160.3590.3980.4330.4641180.3730.4220.4640.5010.5340.562118.50.4390.4890.5270.5620.5930.6191190.5180.5620.5990.6310.6580.6811200.7200.7500.7740.7940.8110.8251211.001.001.001.001.001.001221.391.331.291.251.231.21第五十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日51芽孢的特性芽孢是休眠體Endospore與Exospore形成芽孢的細(xì)菌種類(lèi)芽孢的特性常用芽孢嗜熱脂肪芽孢桿菌的內(nèi)生孢子梭狀芽孢桿菌成熟芽孢的電鏡照片第五十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日52適用于不同滅菌工藝的生物指示劑濕熱滅菌法驗(yàn)證用生物指示劑，詳見(jiàn)后述干熱滅菌法驗(yàn)證用生物指示劑枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilisv.niger)孢子，現(xiàn)稱(chēng)為萎縮芽孢桿菌(Bacillusatropheus)孢子內(nèi)毒素挑戰(zhàn)去熱原工藝驗(yàn)證替代生物指示劑驗(yàn)證

化學(xué)滅菌法驗(yàn)證用生物指示劑

嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)孢子第五十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日53適用于不同滅菌工藝的生物指示劑輻射滅菌法驗(yàn)證用生物指示劑

短小芽孢桿菌(Bacilluspumillus)孢子

環(huán)氧乙烷滅菌用生物指示劑枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilisv.niger)孢子，現(xiàn)稱(chēng)為萎縮芽孢桿菌(Bacillusatropheus)孢子汽態(tài)過(guò)氧化氫（VPHP）滅菌用生物指示劑

嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)孢子梭狀芽孢桿菌(Clostridiumsporogenes)孢子枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)孢子第五十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日54濕熱滅菌驗(yàn)證常用的BI在過(guò)度殺滅程序的確認(rèn)中，最常采用BI：嗜熱脂肪芽孢桿菌/Geobacillusstearothermophilus，前稱(chēng)Bacillusstearothermophilus；也可采用其他對(duì)濕熱滅菌耐熱性強(qiáng)的微生物。在采用“殘存概率法”確認(rèn)中，典型的BI有：Clostridumsporogenes（生孢梭菌，梭狀芽孢桿菌

）Bacillusatrophaeus（萎縮芽孢桿菌）Bacillussmithii（史密氏桿菌，前稱(chēng)凝結(jié)芽孢桿菌）Bacillussubtilis（枯草芽孢桿菌5230）第五十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日55常用BI的D值范圍菌種名稱(chēng)D121值范圍(min)嗜熱脂肪芽孢桿菌Geobacillusstearothermophilus1.5-3.0枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis0.3-0.7凝結(jié)芽孢桿菌Bacilluscoagulans0.4-0.8梭狀芽孢桿菌Clostridumsporogenes0.4-1.0第五十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日56ISO標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)規(guī)定熱穩(wěn)定產(chǎn)品適用的菌種有G.stearothermuphlus或本ISO11138其它部分所要求同樣性能的微生物。例如GeobacillusstearothermophilusATCC7953(5230)，…ATCC12980等注Bacillusstearothermophilus已重新命名為Geobacillusstearothermophilus.熱穩(wěn)定性較差的產(chǎn)品：低于121℃，如不用Geobacillusstearothermophilus，可用BacillussubtilisATCC35021(5230)，但需測(cè)試其耐熱性第五十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日57ISO標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)規(guī)定接種的載體及BI，活菌數(shù)應(yīng)≥1.0×10E5耐熱性可以121℃下的D值表示。每批BI或其已接種的載體的D值，應(yīng)以121℃下的分鐘數(shù)表示，至少應(yīng)至小數(shù)點(diǎn)后的一位。已接種懸浮液或載體的D121應(yīng)≥1.5分鐘。如果是其它菌種，則應(yīng)有D參數(shù)的相關(guān)技術(shù)?！⑸锏膠應(yīng)有3個(gè)點(diǎn)，溫度范圍在110℃~130℃間，z值應(yīng)≥6℃。第五十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日58滅菌程序殺滅力的表述生物殺滅力（FBiological）用以證明滅菌程序殺滅效果的標(biāo)準(zhǔn)BI制劑試驗(yàn)結(jié)果可直接反映滅菌效果有時(shí)可取代物理手段的不足(如探頭無(wú)法放入)局限性：較難進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析物理殺滅力（FPhysical）長(zhǎng)期的試驗(yàn)確立了標(biāo)準(zhǔn)滅菌時(shí)間Fo與微生物殺滅的效果的相關(guān)性，因此，人們常將它作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)精確測(cè)定熱分布和熱穿透狀況，用于計(jì)算不同滅菌程序的滅菌效果測(cè)量數(shù)據(jù)便于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析第五十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日59滅菌程序PQ合格標(biāo)準(zhǔn)物理確認(rèn)的合格標(biāo)準(zhǔn)(示例)如下：用熱穿透探頭測(cè)得超過(guò)設(shè)定溫度的最短及最長(zhǎng)時(shí)間F0的下限及上限；滅菌階段結(jié)束時(shí)的最低F0值滅菌階段的最低和最高壓力飽和蒸汽溫度和壓力之間的關(guān)系滅菌階段腔室的最低和最高溫度熱穿透溫度探頭之間的最大溫差或F0的變化范圍熱分布試驗(yàn)中溫度探頭間的最大溫差最長(zhǎng)平衡時(shí)間；最少正常運(yùn)行的探頭數(shù)第五十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日60滅菌程序PQ合格標(biāo)準(zhǔn)-續(xù)生物確認(rèn)合格標(biāo)準(zhǔn)（示例）：微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)中，孢子的對(duì)數(shù)下降值符合預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的陽(yáng)性和陰性對(duì)照符合設(shè)定要求應(yīng)在滅菌程序性能確認(rèn)中進(jìn)行必要的論證，證明FPHY和FBIO間大體上一致（基本一致：F生物可能小些，F(xiàn)物理可能大些）

第六十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日61BI驗(yàn)證-過(guò)度殺滅工藝選擇與滅菌條件（工藝、對(duì)象及程序）相適應(yīng)的生物指示劑，最常用的是（B.stearothermophilusATCC7953，D121分，接種量10E5–10E6個(gè)孢子）生物指示劑與溫度探頭并列在同一部位(10-20支)按規(guī)定條件培養(yǎng)生物指示劑，如嗜熱脂肪芽孢桿菌的培養(yǎng)溫度為55-60℃，培養(yǎng)7天，每天檢查。對(duì)生物指示劑用培養(yǎng)基進(jìn)行促菌生長(zhǎng)檢查進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)所有經(jīng)挑戰(zhàn)試驗(yàn)的樣品均呈陰性第六十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日62BI驗(yàn)證–殘存概率工藝殘存概率的滅菌工藝中，產(chǎn)品的污染水平及其耐熱性是滅菌終點(diǎn)的決定性因素?！瓚?yīng)將防止產(chǎn)品被耐熱菌污染放在首位，而不是依賴(lài)最終滅菌去消除污染。選擇與滅菌條件（工藝、對(duì)象及程序）相適應(yīng)的BI生物指示劑的耐熱性不得低于孢子在相應(yīng)產(chǎn)品中的耐熱性不得低于產(chǎn)品中污染菌的耐熱性用于每次挑戰(zhàn)試驗(yàn)的所有BI批號(hào)必須相同.BI接種量的計(jì)算：Fo

=D121.×(lgN0-lgNt)上式中，F(xiàn)o、D121、lgNt（藥典標(biāo)準(zhǔn)）均已知，只需計(jì)算N0第六十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日63液體裝載滅菌程序的確認(rèn)為了對(duì)液體裝載進(jìn)行BI確認(rèn)，在密封的、灌封液體的容器和密封件上要接種適當(dāng)?shù)腂I。液體介質(zhì)可用產(chǎn)品或適當(dāng)?shù)拇闷?。如果液體產(chǎn)品含有防腐劑或其他抗生素成分，…，可能有必要用液體替代品作為懸浮劑。使用何種產(chǎn)品作為懸浮劑需要有試驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持，證明它們不抑制微生物的生長(zhǎng)。BI通常被隨機(jī)地或以幾何模式放置在整個(gè)裝載區(qū)的容器中，包括開(kāi)發(fā)階段確定的冷點(diǎn)位置。熱穿透試驗(yàn)探頭應(yīng)放置在接種的容器或其旁側(cè)，以監(jiān)測(cè)滅菌程序的熱輸入情況。第六十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日64多孔/堅(jiān)硬裝載程序的確認(rèn)多孔/堅(jiān)硬裝載生物指示劑確認(rèn)中所用的生物指示劑主要由市場(chǎng)購(gòu)得，它們可以放置在紙上、不銹鋼、鋁或其他基質(zhì)上。另一種可選的方式，是將孢子接種在設(shè)計(jì)的試樣上。密封在安瓿中的生物指示劑可能并不能反映多孔/堅(jiān)硬裝載的實(shí)際情況。將BI挑戰(zhàn)系統(tǒng)放置在物品加熱最慢的部位--最難滅菌的部位。例如，這些部位可能存在于筒式過(guò)濾器的褶皺中，或者在長(zhǎng)軟管的中部（那里可能夾帶空氣），或者在蒸汽難以穿透的橡膠塞與瓶的密封口上。第六十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日65BI驗(yàn)證中常見(jiàn)的問(wèn)題BI無(wú)出廠證或證書(shū)不符合要求供貨商不提供每個(gè)單元中的BI數(shù)量無(wú)耐熱性數(shù)據(jù)BI驗(yàn)證的實(shí)測(cè)結(jié)果與理論計(jì)算相差太大市售BI的耐熱性高，產(chǎn)品不能經(jīng)受過(guò)度殺滅，企業(yè)不知道如何接種初始菌量許多人不知如何計(jì)算，如何評(píng)估第六十五頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日66BI初始量及D值的確定PDATRNo12007提出以下公式：LgNF=LgN0-F(T,Z)/DT，即LgN0=LgNF＋F/D（見(jiàn)第52頁(yè)幻燈片中的等式1）F滅菌程序設(shè)計(jì)期望獲得的殺滅力/滅菌時(shí)間D挑戰(zhàn)試驗(yàn)中BI的耐熱性N0

挑戰(zhàn)菌的起始濃度（接種量）NF滅菌程序結(jié)束后，挑戰(zhàn)菌的存活數(shù)量。為了方便計(jì)算，如果將挑戰(zhàn)菌全部殺滅，可以認(rèn)為存活數(shù)小于1，在此等式中，可取NF為10E0表示。第六十六頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日67孢子液的使用要求孢子在標(biāo)準(zhǔn)溶液中的耐熱性≥孢子在產(chǎn)品溶液中的耐熱性孢子的耐熱性在標(biāo)準(zhǔn)溶液中比較穩(wěn)定有孢子在標(biāo)準(zhǔn)溶液中的耐熱性資料標(biāo)準(zhǔn)溶液更方便于制備和檢測(cè)適用于替代滅菌程序相近的不同產(chǎn)品的滅菌工藝驗(yàn)證生物指示劑的D值測(cè)定方法（另文）第六十七頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日68實(shí)例分析第六十八頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日691.

D值的測(cè)定實(shí)例分析第六十九頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日D值的影響因素物理、化學(xué)條件、環(huán)境因素、濕度，如：孢子所處的介質(zhì)、測(cè)試溫度、內(nèi)包裝材料滅菌時(shí)間（由加熱和冷卻滯后所致的影響）加熱和培養(yǎng)計(jì)數(shù)之間的溫度、時(shí)間和環(huán)境條件用來(lái)培養(yǎng)計(jì)數(shù)滅菌后孢子的培養(yǎng)基等芽孢是否處于被包裹狀態(tài)，此狀態(tài)會(huì)使其耐熱性大大增強(qiáng)微生物的耐熱性（或統(tǒng)稱(chēng)對(duì)滅菌劑的耐受性）第七十頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日70D值的影響因素-續(xù)影響微生物的耐熱性因素還包括：在氯化鈉或氯化鉀存在條件下，G..嗜熱脂肪桿菌的耐熱性會(huì)增強(qiáng)；在二價(jià)鈣離子和鎂離子存在時(shí)，B.凝結(jié)芽孢桿菌的耐熱性也會(huì)增強(qiáng)；在鉀離子存在的情況下，C.梭狀芽孢梭菌的耐熱性會(huì)增強(qiáng)鰲合劑的存在（如檸檬酸）也會(huì)影響耐熱性，強(qiáng)鰲合劑可以競(jìng)爭(zhēng)性作用周?chē)碾x子，使包衣式芽孢的耐熱性產(chǎn)生變化。在接種的載體上（例如紙或橡膠），也可觀察到相似的耐熱性差異。……第七十一頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日71DT值的確定方法DirectEnumerationMethod直接計(jì)數(shù)法

又稱(chēng)SurvivalCurveMethod殘存曲線法FractionNegativeMethod陰性分?jǐn)?shù)法

-Spearman-KarberMethod史丕曼-卡伯法

-Stumbo,Murphy,andCochranMethod

第七十二頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日D值測(cè)定儀器Biological

Indicator—EvaluatorResistometer(簡(jiǎn)稱(chēng)BIER/Vessel)油浴裝置–用于殘存曲線法

第七十三頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日D值測(cè)定儀器的典型溫度曲線溫度時(shí)間(分鐘)第七十四頁(yè)，共八十二頁(yè)，2022年，8月28日殘存曲線法測(cè)定D值儀器及材料油浴（適宜的溫度范圍，精度，容量）毛細(xì)管與支架試驗(yàn)用芽孢懸浮液準(zhǔn)備工作懸浮液占試驗(yàn)懸浮液比例不超過(guò)10%每0.05ml試驗(yàn)懸