第三章基因工程載體演示文稿

第三章基因工程載體演示文稿第一頁(yè)，共三十五頁(yè)。優(yōu)選第三章基因工程載體第二頁(yè)，共三十五頁(yè)。

（1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制，ori。（3）多克隆位點(diǎn)：外源基因插入的單一限制酶位點(diǎn)。2.基因工程對(duì)載體的要求（7）具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移。（2）有選擇性標(biāo)記

Ampr、Tetr、Kanr等。（4）分子量小，可容納較大的外源基因片段。（5）拷貝數(shù)多，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。（6）具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性。第三頁(yè)，共三十五頁(yè)。載體的種類

基因工程中常用的載體有5類：

質(zhì)粒（plasmid）

單鏈DNA噬菌體M13

噬菌體的衍生物柯斯質(zhì)粒（cosmid）

動(dòng)物病毒（virus）

第四頁(yè)，共三十五頁(yè)。第一節(jié)

質(zhì)粒載體

一、質(zhì)粒（plasmid）獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子（CovalentlyClosedCircularDNA,ccc

DNA）。并不是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的，但可以賦予細(xì)胞某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力，如抗生素抗性、對(duì)重金屬離子的抗性、分泌細(xì)菌毒素等。分子量在1-500kb之間廣泛存在于細(xì)菌。第五頁(yè)，共三十五頁(yè)。第六頁(yè)，共三十五頁(yè)。5.根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建1、質(zhì)粒構(gòu)建基本策略1.加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于選擇轉(zhuǎn)化體2.增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組3.縮短長(zhǎng)度，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量4.改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝第七頁(yè)，共三十五頁(yè)。第八頁(yè)，共三十五頁(yè)。1.pBR322：p:質(zhì)粒；BR：質(zhì)粒兩位主要構(gòu)建者姓氏的第一個(gè)字母；322：實(shí)驗(yàn)編號(hào)人工構(gòu)建載體三個(gè)親本質(zhì)粒：pMB1:出發(fā)質(zhì)粒(ColE1)pSF2124:AmprpSC101:TetrpSF2124pMB1pSC101四、經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體第九頁(yè)，共三十五頁(yè)。氨芐青霉素和四環(huán)素抗性24個(gè)單一克隆位點(diǎn)。9個(gè)導(dǎo)致Tetr基因失活3個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活第十頁(yè)，共三十五頁(yè)。氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞可達(dá)1000~3000copies③

安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過(guò)接合轉(zhuǎn)移。②高拷貝數(shù)

①

分子小，克隆能力大長(zhǎng)度4363bp，易于純化，可以攜帶6-8Kb的外源DNA片段。④具有較多的單一酶切位點(diǎn)（24種）第十一頁(yè)，共三十五頁(yè)。4、pUC質(zhì)粒載體1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技術(shù)在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建的結(jié)構(gòu)：（1）來(lái)自于pBR322的Ori（2）氨芐青霉素的抗性基因(ampr)。

但核苷酸序列發(fā)生了變化（3）LacZ′基因

編碼β—半乳糖酶的α—肽鏈（4）MCS區(qū)段

（MCS）區(qū)段位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點(diǎn)。但它并不破壞該基因的功能。第十二頁(yè)，共三十五頁(yè)。與pBR322相比，pUC質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)：（1）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)

如pUC8為2750bp，pUCl8為2686bp，控制質(zhì)粒復(fù)制rop基因的缺失，平均每個(gè)細(xì)胞即可達(dá)500～700個(gè)拷貝（2）適用于組織化學(xué)法檢測(cè)重組體

通過(guò)-互補(bǔ)作用，利用菌落顏色篩選重組子。而pBR322質(zhì)粒的重組子要進(jìn)行兩步的選擇。

（3）具有多克隆位點(diǎn)區(qū)段（MCS）

適合不同粘性末端的DNA片段插入，不必連接接頭

第十三頁(yè)，共三十五頁(yè)。

釋放出的藍(lán)色物質(zhì)可以將整個(gè)菌落染成藍(lán)色，非常容易辨別，如果LacZ’插入外源基因被破壞，菌落則是白色的

。組織化學(xué)法檢測(cè)重組體X-Gal-半乳糖苷酶IPTG誘導(dǎo)物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷

半乳糖

5-溴-4-氯-靛藍(lán)＋第十四頁(yè)，共三十五頁(yè)。第十五頁(yè)，共三十五頁(yè)。第二節(jié)噬菌體載體組成：蛋白質(zhì)、核酸.結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼、尾巴尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。是比細(xì)菌還小得多的微生物，噬菌體侵犯細(xì)菌，可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲(chóng)”。Bacteriophage(phage)第十六頁(yè)，共三十五頁(yè)。一、大腸桿菌的λ-噬菌體DNA（1）線狀雙鏈DNA，兩端各有一個(gè)12bp的互補(bǔ)單鏈（粘性末端，cohesive-endsite），稱λcossite，粘性末端粘連接變成環(huán)狀DNA。（一）λ-噬菌體的生物學(xué)特性1、由外殼包裝蛋白和λ-DNA組成λcos位點(diǎn)是噬菌體包裝必需序列。

2、λ-DNA的物理圖譜48.5kb第十七頁(yè)，共三十五頁(yè)。（2）功能相近的基因在基因組中聚集在一起

目前已經(jīng)被確定的基因至少61種，一半為必需基因第十八頁(yè)，共三十五頁(yè)。（二）λ噬菌體載體的構(gòu)建1.選用λ噬菌體作為構(gòu)建克隆載體材料的依據(jù)是一種溫和噬菌體。能承載比較大的外源DNA片段λDNA分子上有多種限制酶的識(shí)別位點(diǎn)2.構(gòu)建λ噬菌體克隆載體的技術(shù)路線用限制酶切去λDNA上的非必需區(qū)在λDNA上非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標(biāo)記基因建立λDNA分子體外包裝系統(tǒng)第十九頁(yè)，共三十五頁(yè)。第二十頁(yè)，共三十五頁(yè)。

（1）插入式載體只具有一個(gè)可供外源DNA插入的限制酶位點(diǎn)的λ噬菌體。常用：λgt10、λNM1149等載體.（2）置換型載體（取代型載體）具有成對(duì)的限制酶位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的λDNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。

常用：EMBL3、EMBL4二.λ噬菌體載體的主要類型第二十一頁(yè)，共三十五頁(yè)。三、λ-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)可在體外包裝成噬菌體顆粒，高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組。λ-DNA分子的篩選較為方便。

λ-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，常用于構(gòu)建基因文庫(kù)缺點(diǎn)：(1)需要包裝比較麻煩，包裝率又不穩(wěn)定，購(gòu)買包裝蛋白的費(fèi)用又高；(2)沒(méi)有質(zhì)粒的用途廣泛。第二十二頁(yè)，共三十五頁(yè)。第三節(jié)、人工染色體克隆載體

基本元件：含有質(zhì)?？寺≥d體所必需的第一受體（大腸桿菌）的質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)；第二受體（如酵母菌）染色體DNA著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始點(diǎn)的序列.合適的選擇標(biāo)記基因。

利用染色體的復(fù)制元件來(lái)驅(qū)動(dòng)外源DNA片段復(fù)制的載體。酵母人工染色體（YAC）細(xì)菌人工染色體（BAC）第二十三頁(yè)，共三十五頁(yè)。（一）酵母人工染色體（YAC）

把酵母染色體與基因復(fù)制和表達(dá)有關(guān)的主要組件都組裝在質(zhì)粒上，令質(zhì)粒行使酵母chr的轉(zhuǎn)錄功能和復(fù)制功能。

裝載量為350-400kb含有的元件：酵母自主復(fù)制序列(ARS)著絲粒序列(cen)四膜蟲(chóng)端粒（tel）質(zhì)粒選擇標(biāo)記酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)第二十四頁(yè)，共三十五頁(yè)。一、YAC的基本序列元件酵母染色體DNA自主復(fù)制序列（ARS）酵母染色體的著絲粒序列（CEN）酵母染色體的端粒序列（TEL）酵母人工染色體（YAC）YAC載體主要是用來(lái)構(gòu)建大片段DNA文庫(kù)，特別用來(lái)構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫(kù)，并不用作常規(guī)的基因克隆。

第二十五頁(yè)，共三十五頁(yè)。酵母自主復(fù)制序列（ARS)

一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必需的信號(hào)。

第二十六頁(yè)，共三十五頁(yè)。酵母著絲點(diǎn)(CEN)在YAC中起到保證一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)人工染色體的作用。pYAC4：酵母第四條染色體的著絲粒。第二十七頁(yè)，共三十五頁(yè)。正常酵母人工染色體含有：*四膜蟲(chóng)端粒（tel）定位于染色體末端一段序列，用于保護(hù)線狀的DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。第二十八頁(yè)，共三十五頁(yè)。二、

YAC載體的選擇標(biāo)記主要采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因TRP1：色氨酸生物合成基因缺陷型

URA3：尿嘧啶生物合成基因缺陷型

LEU2：亮氨酸合成基因缺陷型

SUP

4：赭石突變抑制基因

第二十九頁(yè)，共三十五頁(yè)?？寺∥稽c(diǎn)：位于sup4基因內(nèi)SuP4是一個(gè)赭石突變（UAA）抑制基因。宿主酵母菌的胸腺嘧啶合成基因帶有一個(gè)赭石突變ade2。在赭石突變宿主中，沒(méi)有外源基因插入時(shí)，sup4基因抑制赭石突變，則形成正常白色菌落；有外源基因插入時(shí)，sup4基因遭破壞，則形成紅色菌落，十分容易挑選出有DNA插入片段的紅色菌落，建成YAC文庫(kù)。第三十頁(yè)，共三十五頁(yè)。YAC克隆DNA片段的過(guò)程是：目的基因在限制性內(nèi)切酶酶解后變成大片段DNA，克隆進(jìn)酵母載體DNA，轉(zhuǎn)染酵母縮主細(xì)胞，擴(kuò)增后，根據(jù)標(biāo)記性狀篩選出重組的人工染色體。三、克隆策略第三十一頁(yè)，共三十五頁(yè)。酵母人工染色體的使用第三十二頁(yè)，共三十五頁(yè)。四、酵母人工染色體（YAC）缺點(diǎn)首先，在YAC載體的插入片段會(huì)出現(xiàn)缺失和基因重排的現(xiàn)象。其次，容易形成嵌合體。嵌合就是在單個(gè)YAC中的插入片段由2個(gè)或多個(gè)的獨(dú)立基因組片段連接組成。嵌合克隆約占總克隆的5%～50%。第三，YAC染色體與宿主細(xì)胞的染色體大小相近，就很難從中分離出來(lái)，影響了YAC載體的廣泛應(yīng)用。

第三十三頁(yè)，共三十五頁(yè)。（二）細(xì)菌人工染色體（BAC）

1992年Shizuya利用F因子的復(fù)制起點(diǎn)和氯霉素抗性標(biāo)記基因，在F質(zhì)粒（pMBO131）基礎(chǔ)上構(gòu)建了第一代BAC人工染色體。能夠克隆和保持大于