分子生物學(xué)試驗(yàn)Experimentsofmolecularbiology

分子生物學(xué)試驗(yàn)

Experimentsofmolecularbiology一、教學(xué)目的《分子生物學(xué)試驗(yàn)》課程主要從提取和分析遺傳物質(zhì)和基因?yàn)榛A(chǔ)，從DNA的分別、純化、克隆到目的基因的鑒定、表達(dá)等過程設(shè)計(jì)了一系列基礎(chǔ)試驗(yàn)，形成一個(gè)涵蓋現(xiàn)代分子生物學(xué)基礎(chǔ)試驗(yàn)內(nèi)容的試驗(yàn)課程教學(xué)體系，包括現(xiàn)代分子生物學(xué)基本技術(shù)方法，幫助學(xué)生鞏固有關(guān)分子生物學(xué)的相關(guān)理論學(xué)問，并較系統(tǒng)地學(xué)習(xí)和駕馭分子生物學(xué)的基本試驗(yàn)方法、技術(shù)和操作技能。二、教學(xué)要求通過學(xué)習(xí)使學(xué)生對(duì)全部試驗(yàn)內(nèi)容有一個(gè)整體的了解；熟悉分子生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)（包括DNA技術(shù)、RNA技術(shù)、蛋白質(zhì)技術(shù)、雜交技術(shù)等）的基本原理方法，駕馭DNA提取純化,定量,DNA克隆,電泳等基本試驗(yàn)技術(shù)，重點(diǎn)駕馭質(zhì)粒DNA純化技術(shù),酶切技術(shù),DNA片段回收,重組連接技術(shù),電泳技術(shù),轉(zhuǎn)化技術(shù),基本PCR技術(shù)以及蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)技術(shù)等；要求學(xué)生分子生物學(xué)試驗(yàn)試驗(yàn)室操作平安與污染物處理；學(xué)習(xí)儀器設(shè)備的運(yùn)用分子生物學(xué)試驗(yàn)室要求穿試驗(yàn)服進(jìn)入試驗(yàn)室；保持試驗(yàn)室安靜；保持試驗(yàn)室清潔干凈和試驗(yàn)臺(tái)面整齊；試驗(yàn)前要預(yù)習(xí)試驗(yàn)教材；不準(zhǔn)穿拖鞋進(jìn)入試驗(yàn)室；不準(zhǔn)在試驗(yàn)室吃東西、喝水；要求刷卡進(jìn)入試驗(yàn)室；

試驗(yàn)一核酸的提取

（質(zhì)粒DNA的提取和純化）【目的要求】1．學(xué)習(xí)載體的基本結(jié)構(gòu)2．了解堿裂解法質(zhì)粒提取過程中各步驟的設(shè)計(jì)思想；3．駕馭堿裂解法提取質(zhì)粒的原理方法和各項(xiàng)基本技術(shù)；【試驗(yàn)原理】堿裂解法提取質(zhì)粒是依據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分別質(zhì)粒DNA。在pH值介于12.0-12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液復(fù)原pH至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性快速而精確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會(huì)那么快速而精確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去?！驹囼?yàn)材料和用品】恒溫培育箱、恒溫?fù)u床、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋、Enpendorf管、含pET-29a質(zhì)粒及含目的基因質(zhì)粒的大腸桿菌、堿裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、TE緩沖液、胰RNA酶

【試驗(yàn)步驟】1.Picksinglecolonyandinoculate5mlofLBbrothcontaining200g/lAmpicillinor1mg/5mlwithaloosenedcapandapieceoftapetoholditinplace.Shakeat250RPM37oCovernight.2.Centrifuge1.5mLcellsin1.5mLEppendorftubeattopspeedfor1minute.Discardsupernatant.

3.Resuspendcellpelletin100ulofGTEbuffer(50mMGlucose,25mMTris-Cl,10mMEDTA,pH8).

Vortexgentlyifnecessary.4.Add100ulofNaOHandSDSlysissolution(0.2MNaOH,1%SDS)respectively.Inverttube6-8times.5.IMMEDIATELYadd150ulof5Mpotassiumacetatesolution(pH4.8).ThissolutionneutralizesNaOHinthepreviouslysisstepwhileprecipitatingthegenomicDNAandSDSinaninsolublewhiteprecipitate.Spinattopspeed1min.6.Transfersupernatanttonewtube,beingcarefulnottopickupanywhiteflakes.

Precipitatethenucleicacidswith0.5mLofisopropanolonicefor10minutesandcentrifugeattopspeedfor1minute.7.Aspirateoffalltheisopropanolsupernatant.Dissolvethepelletin0.4mlofTEbuffer(10mMTris-Cl,1mMEDTA,pH7.5).Add10ulofRNAseAsolution(20mg/mlstockstoredat-20°C),vortexandincubateat37°Cfor20to30minutestodigestremainingRNA.8.ExtractproteinsfromtheplasmidDNAusingphenol/chloroform/isoamylalcohol(PCIA)byaddingabout0.4ml.Vortexvigorouslyfor30seconds.Centrifugeatfullspeedfor5minutesatroomtemperature.NoteorganicPCIAlayerwillbeatthebottomofthetube.9.RemoveupperaqueouslayercontainingtheplasmidDNAcarefullyavoidingthewhiteprecipitatedproteinlayerabovethePCIAlayer,transferringtoaclean1.5mleppendorftube.10.Repeat9stepagain.11.Add1mlofabsoluteethanoltoprecipitatetheplasmidDNAand50mlof3MSodiunacetatesolutiononicefor10minutes.Centrifugeatfullspeedfor5minutesatroomtemperature.12.DiscardethanolsolutionandresuspendDNApelletin50ulofTEbuffer.13.Dissolve5uLin995ulofwater,andspec(blankspectrophotometertowater).Theabsorbanceat260nmmultipliedbytenistheconcentrationoftheDNAinunitsofmg/mlfora1cmpathlengthcuvette(i.e.50mg/ml/OD260nm).14.Storeitat-20°C.核酸的分別與純化不論是基因工程還是蛋白質(zhì)工程，核酸分子是這些技術(shù)應(yīng)用所涉及的主要對(duì)象，所以核酸的分別與提取是生化與分子生物學(xué)探討中特殊重要的基本技術(shù)。核酸樣品的質(zhì)量將干脆關(guān)系到試驗(yàn)的成敗。核酸的種類：真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子；真核細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子；原核生物的基因組DNA、質(zhì)粒DNA為雙鏈環(huán)狀分子；RNA分子在大多數(shù)生物體內(nèi)均是單鏈線性分子；不同類型的RNA分子可具有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如真核mRNA分子多數(shù)在3’端帶有ploy(A)結(jié)構(gòu);tRNA

的三葉草結(jié)構(gòu)。病毒的DNA、RNA，其存在形式多種多樣，有雙鏈環(huán)狀、單鏈環(huán)狀、雙鏈線狀和單鏈線狀等。一、核酸分別提取的原則分別純化核酸總的原則①應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；②解除其它分子的污染，保證較高純度。3.為了保征分別核酸的完整性和純度，在試驗(yàn)過程中，應(yīng)留意以下事宜：①盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過程，以削減各種有害因素對(duì)核酸的破壞；②削減化學(xué)因素對(duì)核酸的降解，為避開過酸、過堿對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4-10條件下進(jìn)行；③削減物理因素對(duì)核酸的破壞，物理破壞因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。④防止核酸的生物降解，細(xì)胞內(nèi)或外界的各種核酸酶（DNA酶、RNA酶）酶解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，干脆破壞核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。其中DNA酶，須要金屬二價(jià)離子Mg2+，Ca2+的激活，運(yùn)用金屬二價(jià)離子螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸鹽，基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶，不但分布廣泛、極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不易失活，所以生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素。提取高質(zhì)量基因組DNA的主要用途：PCR擴(kuò)增的模板用于構(gòu)建基因組文庫(kù)用于Southernblot雜交分析二、真核細(xì)胞染色體DNA的制備

真核細(xì)胞染色體DNA的制備過程

1.真核細(xì)胞的裂開（1）物理方式:超聲波法、勻漿法、液氮裂開法、Al2O3粉研磨法等。這些物理操作均可導(dǎo)致DNA鏈的斷裂。（2）為了獲得大分子量的DNA，一般接受蛋白酶K和去污劑和順處理法。2.去除蛋白質(zhì)常用酚、氯仿抽提。反復(fù)的抽提操作對(duì)DNA鏈的機(jī)械剪切機(jī)會(huì)較多，所以有人運(yùn)用高濃度甲酰胺解聚核蛋白聯(lián)合透析的方法，可以獲得200kb以上的DNA片段，適用于粘粒(cosmid)構(gòu)建基因組文庫(kù)。依據(jù)不同的試驗(yàn)要求，可選擇不同的試驗(yàn)方法制備真核細(xì)胞染色體DNA。3.DNA沉淀：一般接受2倍體積乙醇沉淀或用異丙醇（0.6）4.DNA溶解：一般接受TE三、RNA的分別與純化-真核細(xì)胞RNA的制備從細(xì)胞中分別RNA的純度與完整性對(duì)于很多分子生物學(xué)試驗(yàn)至關(guān)重要。如Northernblot及cDNA合成及體外翻譯等試驗(yàn)的成敗，在很大程度上確定于RNA的質(zhì)量。RNA主要由以下幾類分子組成：rRNA(占RNA總量的80％—85％)、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(占10％-15％)、mRNA(占1％～5％)。rRNA在總RNA分子中含量最豐富，由28S、18S、5S及4S幾類組成，它們之間同源性大，分子量變更不大，所以可依據(jù)它們的密度和分子大小，通過密度梯度離心，凝膠電泳或離子交換層析進(jìn)行分別。mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一，在細(xì)胞中含量少，絕大多數(shù)mRNA分子(除血紅蛋白及有些組蛋白mRNA以外)，均在3’端存在20-250個(gè)多聚腺核苷酸poly(A)。利用此特征，可很便利地從總RNA中，用寡聚(dT)親和層析柱分別mRNA。mRNA分子群體編碼細(xì)胞內(nèi)全部的多肽和蛋白質(zhì)，而mRNA是分子生物學(xué)的主要探討對(duì)象之一。鑒定所提取總RNA分子的質(zhì)量，可以通過瓊脂糖電泳后視察是否有明顯得28S、18S條帶來推斷。Fig.1TotalRNAisolatedfromTrichodermareeseiinducedbydifferentinducers圖1.木霉總RNA的分別1.微晶纖維素2.自然稻草粉RNA分別的關(guān)鍵因素是盡量削減

RNA酶的污染！如何創(chuàng)建一個(gè)無RNase的環(huán)境？極力避開外源RNase的污染：主要來源于操作者的手、試驗(yàn)的器皿和試劑盡力抑制內(nèi)源性RNase的活力：主要來源于樣品中的組織細(xì)胞。(1)操作者的手干脆觸摸之處，毫無疑問會(huì)留下RNase，說話帶出的唾液也富含RNase。故整個(gè)操作過程中，應(yīng)戴口罩和手套。(2)空氣中飛塵攜帶的細(xì)菌、霉菌等微生物，也是污染外源RNase的一條途徑，所以操作過程應(yīng)在比較干凈的環(huán)境中進(jìn)行。怎樣去除外源性RNase的污染？(3)玻璃器經(jīng)過常規(guī)洗凈后，應(yīng)用0.1％焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)浸泡處理(37℃，2小時(shí))，再用雙蒸滅菌水漂洗幾次。高壓消毒去除DEPC，然后200℃烘烤4小時(shí)以上或180℃烘烤過夜。(4)塑料器材最好運(yùn)用滅菌的一次性塑料用品，Eppendorf管、微量加樣吸頭最好是新的，運(yùn)用前進(jìn)行高壓蒸汽消毒。(5)全部溶液應(yīng)加DEPC至0.1％，室溫處理過夜，或室溫下磁力攪拌20分鐘，然后高壓蒸汽滅菌處理（或加熱至70℃1小時(shí)或60℃過夜，以去除全部殘留的DEPC）。(6)所用的化學(xué)試劑應(yīng)為新包裝，稱量時(shí)運(yùn)用干烤處理的稱量勺。全部操作均應(yīng)在冰浴中進(jìn)行，低溫條件可減低RNA酶的活性。要盡可能早地去除細(xì)胞內(nèi)蛋白，加入RNase抑制劑，力爭(zhēng)在提取的起始階段對(duì)RNase活力進(jìn)行有效地抑制。

如何抑制內(nèi)源性RNase的活性？RNase抑制物：（1）低特異性RNase抑制物：不同類型的低特異性RNase抑制物均可不同程度地抑制Raise的活性，其中包括DEPC

皂土(bentonite):Al2O3·4SiO2·H2O復(fù)合硅酸鹽(Macaloid)肝素氧釩基—核苷復(fù)合物多胺（2）去除蛋白質(zhì)的物質(zhì)：蛋白質(zhì)變性劑：酚、氯仿；尿素蛋白酶K去污劑：SDS、十二烷酰肌氨酸鈉(sarkosyl)、脫氧膽酸鈉(DOC)是陰離子去污劑解偶劑(胍類)：鹽酸胍、異硫氰酸胍是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消逝，細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白快速與核酸分別，所以又稱解偶劑。（3）RNase的特異抑制劑RNase阻抑蛋白(RNasin)：這是一類從大鼠肝或人胎盤中提取出來的酸性糖蛋白質(zhì)。RNasin能與RNase非共價(jià)結(jié)合從而抑制它們的活力，RNasin是RNA酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。抑制效果較好，被廣泛用于體外翻譯體系、mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及體外轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。Youwillneed:Guanidineisothiocyanate(Sigma)

1Msodiumcitrate,pH7(DEPC-treated,autoclaved)

Sarcosyl(Na-laurylsarcosine,Sigma)

b-mercaptoethanol(Sigma)

2Msodiumacetate,pH4(DEPC-treated,autoclaved)

3Msodiumacetate,100mMmagnesiumacetate,pH5.2

Absoluteethanol

Propan-2-ol(isopropanol)

70%ethanol(madewithDEPC-treated,autoclavedwater)

0.5%SDS(madewithsterile,DEPC-treatedwater)

SolutionD-4Mguanidineisothiocyanate,25mMsodiumcitrate,pH7,0.5%sarcosyl,100mMb-mercaptoethanol.SolutionDcanbemadeandstoredat4°Cwithoutb-mercaptoethanolforseveralmonths.b-mercaptoethanolshouldbeaddedto100mMimmediatelypriortouse.b-mercaptoethanolisusedtopreventthereformationoftheintra-moleculardisulphidebridges,oneofthereasonsfortheextremestabilityofribonucleases.1)Tissueishomogenizedasrapidlyaspossible,at4°C,insolutionD(500ulper50mgtissue)withaneppendorfpestlehomogenizeruntilasmooth,lysed,homogenoussuspensionisobtained.2)Add50ul2Msodiumacetate,pH4.0andmixvigorously.3)Add500ulphenolandmixvigorously.4)Add100ulchloroform,mixvigorouslyandincubateonicefor15minutes.5)Centrifugemixtureat10,000gfor10minutesinamicrofugeat4°C.6)Removeupper,aqueousphasetoaclean,sterile,DEPC-treatedeppendorftube.Aftercentrifugation,RNAispresentintheaqueousphasewhile,duetoprotonationattheacidicpHused,genomicDNAispartitionedintothephenolphase.7)Extracttheupperaqueouslayerwithanequalvolumephenol/chloroformandcentrifugeasbefore.Repeattheextractionsuntilnointerfacematerialisseen.8)Precipitatetheaqueousphasebytheadditionofanequalvolume(500ul)ofpropan-2-ol.Incubateat-20°Cfor20minutes.9)Pellet