纖維素乙醇發(fā)酵全詳解演示文稿

纖維素乙醇發(fā)酵全詳解演示文稿第一頁，共七十五頁。（優(yōu)選）纖維素乙醇發(fā)酵全第二頁，共七十五頁。第二代生物燃料第二代生物燃料以秸稈、草和碎木等農(nóng)業(yè)廢棄物或非糧作物為主要原料，又被稱為纖維素乙醇，或非糧生物燃料。第三頁，共七十五頁。與第一代生物燃料對(duì)比首先，汽車發(fā)動(dòng)機(jī)不需要改造就可以直接使用摻入了生物乙醇的汽油或柴油；其次，生產(chǎn)第二代生物乙醇的催化酶技術(shù)未來幾年成本還將快速下降，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的可行性非常強(qiáng)；第三，秸稈等纖維素類農(nóng)業(yè)廢棄物大量存在，比如中國每年農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大約產(chǎn)生7億噸秸稈，供給非常充足。第四頁，共七十五頁。第五頁，共七十五頁。第六頁，共七十五頁。我國纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展現(xiàn)狀河南天冠集團(tuán)2006年6月26日，河南天冠集團(tuán)建成投產(chǎn)了我國首條秸稈乙醇中試生產(chǎn)線，標(biāo)志著我國在生物質(zhì)能源利用領(lǐng)域已躋身世界行列。目前，在河南天冠集團(tuán)，一條年產(chǎn)300t乙醇的中試生產(chǎn)線已建成投產(chǎn)，6t麥秸可變成1t乙醇。第七頁，共七十五頁。上海華東理工大學(xué)能源化工系，承擔(dān)國家863項(xiàng)目的“農(nóng)林廢棄物制取燃料乙醇技術(shù)”研究，近年已進(jìn)入工業(yè)性試驗(yàn)階段。已建成年產(chǎn)燃料乙醇600t的示范工廠，接下來的問題就是如何產(chǎn)業(yè)化。第八頁，共七十五頁。國家科技支撐計(jì)劃秸稈乙醇關(guān)鍵技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化示范項(xiàng)目已于2008年6月上旬獲得科技部批復(fù)，列入“十一五”國家科技支撐計(jì)劃組織實(shí)施。中國科學(xué)院于2007年12月中旬啟動(dòng)“纖維素乙醇的高溫發(fā)酵和生物煉制”重大項(xiàng)目。第九頁，共七十五頁。國外纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展現(xiàn)狀第十頁，共七十五頁。第十一頁，共七十五頁。纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化亟待解決的關(guān)鍵技術(shù)第十二頁，共七十五頁。第十三頁，共七十五頁。國內(nèi)外預(yù)處理方法的研究動(dòng)態(tài)第十四頁，共七十五頁。第十五頁，共七十五頁。

纖維素酶的生產(chǎn)和纖維素水解技術(shù)研究纖維素酶高產(chǎn)菌種的篩選和誘變育種目前，用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物大多屬于真菌。研究得較多的有木霉屬、曲霉屬、青霉屬等。其中木霉、青霉產(chǎn)生的纖維素酶活力往往最高，酶組分最全。因而應(yīng)用也最廣泛。曲霉和根霉產(chǎn)生的主要是內(nèi)切型纖維素酶，多用于紡織和造紙等纖維的表面加工。纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)纖維素酶的生產(chǎn)可采用液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩類方法。我國采用的固體培養(yǎng)方法包括薄層的曲盤培養(yǎng)、簾子培養(yǎng)和厚層的通風(fēng)培養(yǎng)等。生產(chǎn)上常用的是厚層通風(fēng)培養(yǎng)，亦稱厚層通風(fēng)曲或箱曲，設(shè)備比較簡(jiǎn)單，易于推廣，但容易污染雜菌，溫度和濕度不易控制，大規(guī)模生產(chǎn)難于穩(wěn)定。第十六頁，共七十五頁。在美國能源部的支持下，杰能科(GenencorInternational)和諾維信(NovozymesA／S)兩家酶制劑公司加大了研究力度，努力增加酶活和降低生產(chǎn)成本，取得了引人注目的結(jié)果。諾維信鑒定出多種新酶，配制成新的復(fù)合酶制劑，提高了酶系的降解能力，結(jié)合NREL預(yù)處理技術(shù)的進(jìn)步，使玉米秸產(chǎn)乙醇用酶的成本降至原來的1／30，從2001年的每加侖5美元到2005年的每加侖10—18美分。通過技術(shù)進(jìn)步，杰能科的酶成本也降至原成本的1／30。美國能源部認(rèn)為酶處理成本已不再是產(chǎn)業(yè)化的主要障礙。第十七頁，共七十五頁。乙醇發(fā)酵菌種選育及發(fā)酵過程調(diào)控——汪吳第十八頁，共七十五頁。理想的生物質(zhì)乙醇發(fā)酵菌應(yīng)能發(fā)酵所有生物質(zhì)來源的糖，具有對(duì)木素單體、乙酸和其它抑制性副產(chǎn)物的良好抗性，并同纖維素完全水解所需的纖維素酶有協(xié)同作用。一、纖維素乙醇發(fā)酵菌種選育第十九頁，共七十五頁。從自然界中篩選戊糖發(fā)酵菌種誘變育種采用原生質(zhì)體融合技術(shù)基因工程在菌種選育上的應(yīng)用木糖發(fā)酵菌株選育方法第二十頁，共七十五頁。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單易行，可以達(dá)到純化菌種、防止菌種衰退、穩(wěn)定生產(chǎn)、提高產(chǎn)量等目的。缺點(diǎn)：效率低、進(jìn)展慢，很難使生產(chǎn)水平大幅度提高。自然篩選第二十一頁，共七十五頁。誘變育種化學(xué)誘變劑:硫酸二乙酯(DES)、亞硝基胍(NTG)、亞硝酸(NA)、氮芥(NM)、羥胺等物理誘變劑:如紫外線、X-射線、-射線、快中子、超聲波等營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選抗性突變株的篩選溫度敏感突變型篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選組成型突變株的篩選第二十二頁，共七十五頁。誘變育種實(shí)例樊梓鸞對(duì)熱帶假絲酵母2.402進(jìn)行紫外誘變，通過初篩、復(fù)篩，獲得一株耐酸耐乙醇的酵母菌株UV2。在pH3.5和10％乙醇的培養(yǎng)基中，表現(xiàn)出良好的發(fā)酵性能。在此條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵試驗(yàn)，乙醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)0.329g/g底物，同時(shí)誘變菌株與出發(fā)菌株相比，乙醇轉(zhuǎn)化率提高了28.57%。連續(xù)傳代10次發(fā)酵性能無明顯變化，表明菌株具有一定的遺傳穩(wěn)定性。第二十三頁，共七十五頁。原生質(zhì)體融合育種是雜交育種（基因重組）育種的一種特殊方式目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了樹干畢赤酵母與釀酒酵母的屬間原生質(zhì)體融合。融合子能發(fā)酵木糖產(chǎn)生酒精，其耐酒精的性能也比親株有所提高。原生質(zhì)體融合第二十四頁，共七十五頁。基因工程育種第二十五頁，共七十五頁。大腸桿菌等能有效地利用木質(zhì)纖維素材料的所有糖組分，對(duì)乙醇也有一定耐性(高于50g/L)。但通常乙醇只是這些大腸桿菌產(chǎn)生的眾多產(chǎn)物之一。乙醇高產(chǎn)的關(guān)鍵在于丙酮酸脫羧酶(PDC)、醇脫氫酶(ADH)系統(tǒng)。有人將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌編碼PDC和ADH的基因(pdc和adhb)構(gòu)建成稱為PET的人造操縱子，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并實(shí)現(xiàn)了高表達(dá)，從而將丙酮酸代謝導(dǎo)向產(chǎn)生乙醇。天然底物利用策略第二十六頁，共七十五頁。美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)的張敏等利用復(fù)雜的克隆技術(shù)，構(gòu)建了帶有兩個(gè)獨(dú)立操縱子的雜合穿梭質(zhì)粒(pzB5)，分別編碼大腸桿菌的xylA和xylB基因，以及轉(zhuǎn)酮酶(tktA)轉(zhuǎn)醛酶(tal)基因，成功地轉(zhuǎn)化了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4菌株。重組菌利用木糖作為唯一碳源生長(zhǎng)，能有效地轉(zhuǎn)化理論得率82%~87%的木糖和葡萄糖為乙醇。重組菌底物利用策略第二十七頁，共七十五頁。樊梓鸞研究了高產(chǎn)乙醇酵母菌株的誘變育種篩選產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)的出發(fā)菌株細(xì)胞懸浮液的制備紫外照射繪制致死曲線，確定最大正突變的照射劑量挑選菌株影印培養(yǎng)初篩復(fù)篩發(fā)酵試驗(yàn)菌株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。高產(chǎn)乙醇菌種選育第二十八頁，共七十五頁。供試菌種：南陽酵母2.606(Saccharomycescerevisiae)，熱帶假絲酵母2.637(Candidatropicalis)，熱帶假絲酵母2.402(Candidatropicalis)YEPD液體培養(yǎng)基:酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L。利用杜氏管測(cè)定三種酵母在葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基和混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基中的呼吸情況，從而確定菌株生產(chǎn)乙醇的能力A:篩選產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)的出發(fā)菌株選取熱帶假絲酵母2.402為出發(fā)菌株第二十九頁，共七十五頁。B:紫外誘變——誘變劑量的選擇最佳誘變時(shí)間為30s，致死率為80.30%第三十頁，共七十五頁。C:酵母菌一級(jí)篩選（TTC法）TTC是(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)一種顯色劑，它能對(duì)酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生呈色反應(yīng)，通過它可以判斷酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母產(chǎn)乙醇能力的高低。得到25株酵母菌，隨機(jī)編號(hào)UV1~UV25誘變后菌株TTC下層平板比較菌落顏色影印平板30℃，24h倒入TTC上層培養(yǎng)基30℃，2~3h第三十一頁，共七十五頁。D:酵母菌二級(jí)篩選（杜氏小管法）（1）酵母代謝木糖和葡萄糖混合糖的馴化實(shí)驗(yàn)14株第三十二頁，共七十五頁。（2）酵母耐酸試驗(yàn)8株第三十三頁，共七十五頁。（3）酵母耐乙醇試驗(yàn)第三十四頁，共七十五頁。E:酵母菌三級(jí)篩選(C02失重法)以UV2號(hào)菌株為最終發(fā)酵用菌株。第三十五頁，共七十五頁。F:糖濃度對(duì)乙醇產(chǎn)率的影響第三十六頁，共七十五頁。G:誘變菌株UV2的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)小結(jié)：從優(yōu)良穩(wěn)定的南陽酵母2.606，熱帶假絲酵母2.637和2.402中篩選出可同時(shí)糖化五碳糖和六碳糖，且乙醇產(chǎn)率較高的熱帶假絲酵母2.402進(jìn)行紫外誘變，通過初篩、復(fù)篩，獲得一株耐酸耐乙醇的酵母菌株。在pH3.5和10%乙醇的培養(yǎng)基中，表現(xiàn)出良好的發(fā)酵性能。在此條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵試驗(yàn)，乙醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)0.329g/g底物，同時(shí)誘變菌株與出發(fā)菌株相比，乙醇轉(zhuǎn)化率提高了28.57%。連續(xù)傳代10次發(fā)酵性能無明顯變化，表明菌株具有一定的遺傳穩(wěn)定性。第三十七頁，共七十五頁。纖維素糖化發(fā)酵工藝同步糖化發(fā)酵法（SSF)分批補(bǔ)料技術(shù)和纖維素-淀粉共發(fā)酵水解發(fā)酵二段法（SHF)第三十八頁，共七十五頁。定義：將纖維素先用纖維素酶糖化，再經(jīng)酵母發(fā)酵成酒精的方法。優(yōu)點(diǎn)：可以分別使用水解和發(fā)酵各自的最適條件(分別為50℃和30℃)。缺點(diǎn)：酶水解產(chǎn)生的產(chǎn)物(纖維二糖和葡萄糖)會(huì)反饋抑制水解反應(yīng)水解發(fā)酵二段法（separatehydrolysisandfermentation,SHF）第三十九頁，共七十五頁。SHF方法的改進(jìn)Ghose等將高產(chǎn)菌株綠色木霉QM9123的纖維素酶濃縮5~8倍，加入30%研磨的木質(zhì)纖維素懸浮液，在反應(yīng)器內(nèi)連續(xù)糖化，將生成的葡萄糖通過超過濾膜分離出去，從而消除產(chǎn)物抑制，提高了反應(yīng)速度，流出液的葡萄糖濃度達(dá)10%以上。但膜技術(shù)產(chǎn)業(yè)化有一定困難。第四十頁，共七十五頁。纖維素酶水解和菌體酒精發(fā)酵同時(shí)進(jìn)行的方法。優(yōu)點(diǎn)：在加入纖維素酶的同時(shí)接種酒精發(fā)酵的酵母，可使生成的葡萄糖立即被酵母發(fā)酵成酒精；去除了產(chǎn)物抑制，就可以不妨礙纖維素糖化的繼續(xù)進(jìn)行，酒精得率可明顯提高。關(guān)鍵：選擇最適的酵母，酶解的最適溫度約為50℃，而普通釀酒的最適發(fā)酵溫度通常約30℃。同步糖化發(fā)酵(simultaneoussaccharificationandfermentation,SSF)第四十一頁，共七十五頁。SSF實(shí)例彭林才等人以衛(wèi)生紙廠初級(jí)污泥作為生物質(zhì)原料，采用同步糖化發(fā)酵法生產(chǎn)燃料乙醇，經(jīng)過條件優(yōu)化乙醇質(zhì)量濃度達(dá)19.5g/L，是理論值的63.9%。第四十二頁，共七十五頁。同步糖化共發(fā)酵(simultanenoussaccharificationandcofermentation,SSCF)利用能同時(shí)發(fā)酵戊糖和己糖的穩(wěn)定的基因重組菌株進(jìn)行同步共發(fā)酵。實(shí)例：在中試條件下，經(jīng)過稀酸預(yù)處理的玉米纖維在總固體物濃度為20%、纖維素酶用量為10IFPU/g纖維素、30℃、150rpm、pH5.0條件下，使用普度大學(xué)構(gòu)建的重組酵母LNH-ST菌株進(jìn)行同步糖化共發(fā)酵4天，78.4%的可用葡萄糖和56.1%的可用木糖被轉(zhuǎn)化成乙醇。第四十三頁，共七十五頁。微生物直接轉(zhuǎn)化法(consolidatedbioprocessing,CBP)纖維素酶的生成和乙醇發(fā)酵由一種微生物或一個(gè)微生物群體來實(shí)施。CBP需要的菌株可以通過代謝途徑工程方法構(gòu)建。實(shí)例1：Ingram等將歐文氏菌(Erwinia)的兩種內(nèi)切葡聚糖酶的基因克隆到能生產(chǎn)乙醇的克雷伯氏菌(Klebsiella)中，使該菌配合真菌纖維素酶發(fā)酵纖維素產(chǎn)生的乙醇增加了22%。第四十四頁，共七十五頁。CPB實(shí)例2——粗糙脈胞菌AS31602發(fā)酵生產(chǎn)乙醇粳糙脈孢菌(Neurosporacrassa)AS3.1602具有同時(shí)產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶、發(fā)酵葡萄糖和木糖的能力。張志華對(duì)N.crassaAS3.1602好氧產(chǎn)酶和厭氧直接發(fā)酵纖維素產(chǎn)生乙醇的過程進(jìn)行了代謝分析。以20g/L的微晶纖維素為碳源進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)，好氧發(fā)酵3d時(shí)，菌體處于穩(wěn)定期，F(xiàn)PA酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶酶活和木聚糖酶酶活都處于較高水平。厭氧條件下直接轉(zhuǎn)化20g/L的微晶纖維素，發(fā)酵96h時(shí)乙醇濃度可以達(dá)到6.3g/L，僅檢測(cè)到少量副產(chǎn)物乳酸和乙酸。第四十五頁，共七十五頁。分批補(bǔ)料技術(shù)和纖維素一淀粉共發(fā)酵山東大學(xué)利用造紙廠廢水中回收的細(xì)雜纖維進(jìn)行的酶解產(chǎn)酒精實(shí)驗(yàn)顯示，使用15FPAIU/g纖維素的纖維素酶，起始纖維廢渣濃度10g/100ml(已呈半固態(tài)，沒有多少游離水)，酒醪的酒度也只能達(dá)到2.5%~2.7%(V/W)。在36h時(shí)補(bǔ)加10g纖維廢渣，不要再加纖維素酶，就可繼續(xù)發(fā)酵。最終酒度可以達(dá)到5%(V/W)左右。第四十六頁，共七十五頁。發(fā)酵過程調(diào)控對(duì)于不同的發(fā)酵工藝，其具體影響因素不同，影響發(fā)酵過程的主要因素有：發(fā)酵溫度發(fā)酵時(shí)間纖維素酶用量菌種接種量菌液濃度底物濃度第四十七頁，共七十五頁。實(shí)例1：SSF纖維素轉(zhuǎn)化乙醇最佳工藝參數(shù)確定單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果第四十八頁，共七十五頁。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果在最優(yōu)條件下，乙醇轉(zhuǎn)化率可達(dá)0.368g/g底物，比優(yōu)化前的乙醇轉(zhuǎn)化率提高了10.60%，較出發(fā)菌株提高了36.14%。第四十九頁，共七十五頁。纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇工藝示意圖第五十頁，共七十五頁。葡萄糖發(fā)酵途徑EMP、HMP、ED和PK

第五十一頁，共七十五頁。由葡萄糖到形成丙酮酸的一系列反應(yīng)稱糖酵解，又稱EMP途徑。糖酵解作用一般在無氧情況下進(jìn)行，故又稱無氧分解。第五十二頁，共七十五頁。用酵母使糖變?yōu)橐掖嫉墓こ谭Q為生醇發(fā)酵。酵母等能使丙酮酸脫羧成乙醛，乙醛在醇脫氫酶催化下被NADH還原成乙醇。

該過程只在pH3.5~4.5以及厭氧的條件下發(fā)生。第五十三頁，共七十五頁。當(dāng)發(fā)酵液處在堿性條件下，酵母的乙醇發(fā)酵會(huì)改為甘油發(fā)酵。原因：該條件下產(chǎn)生的乙醛不能作為正常受氫體，結(jié)果2分子乙醛間發(fā)生歧化反應(yīng)，生成1分子乙醇和1分子乙酸；CH3CHO+H2O+NAD+CH3COOH+NADH+H+CH3CHO+NADH+H+CH3CH2OH+NAD+

此時(shí)也由磷酸二羥丙酮擔(dān)任受氫體接受3-磷酸甘油醛脫下的氫而生成-磷酸甘油，后者經(jīng)-磷酸甘油酯酶催化，生成甘油。2葡萄糖2甘油+乙醇+乙酸+2CO2第五十四頁，共七十五頁。戊糖磷酸途徑（HMS），約有30%的葡萄糖可能由此途徑進(jìn)行氧化。第五十五頁，共七十五頁。ED途徑

是少數(shù)缺乏完整EMP的微生物具有的一種替代途徑。關(guān)鍵反應(yīng)：2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸的裂解相關(guān)的發(fā)酵生產(chǎn)：細(xì)菌酒精發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)：代謝速率高，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高，菌體生成少，代謝副產(chǎn)物少，發(fā)酵溫度較高，不必定期供氧。缺點(diǎn)：較易染菌；細(xì)菌對(duì)乙醇耐受力低第五十六頁，共七十五頁。酵母菌（在時(shí)）的乙醇發(fā)酵

~脫羧酶~脫氫酶丙酮酸→乙醛→乙醇通過EMP途徑產(chǎn)生乙醇，總反應(yīng)式為：C6H12O6+2ADP+2Pi→2C2H5OH+2CO2+2ATP

細(xì)菌的乙醇發(fā)酵通過ED途徑產(chǎn)生乙醇，總反應(yīng)如下：葡萄糖+ADP+Pi→2乙醇+2CO2+ATP細(xì)菌的乙醇發(fā)酵通過HMS途徑產(chǎn)生乙醇、乳酸等，總反應(yīng)如下：葡萄糖+ADP+Pi→乳酸+乙醇+CO2+ATP第五十七頁，共七十五頁。由表可見，在微生物細(xì)胞中，有的同時(shí)存在多條途徑來降解葡萄糖，有的只有一種。在某一具體條件下，擁有多條途徑的某種微生物究竟經(jīng)何種途徑代謝，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物影響很大。第五十八頁，共七十五頁。木糖代謝途徑傳統(tǒng)的用于發(fā)酵生產(chǎn)的微生物（釀酒酵母和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌等）能很好地利用葡萄糖，且乙醇發(fā)酵率高，乙醇耐受力強(qiáng)，但均缺少利用木糖的能力。因此近些年來，人們嘗試?yán)么x工程手段改造酵母菌或者細(xì)菌來發(fā)酵木糖等五碳糖生產(chǎn)酒精。第五十九頁，共七十五頁。代謝工程（metabolicengineering）代謝工程是基因工程的一個(gè)重要分支，利用重組DNA為主的技術(shù)，操縱酶的轉(zhuǎn)移和細(xì)胞調(diào)節(jié)功能，定向改造基因組結(jié)構(gòu)，重新設(shè)計(jì)細(xì)胞的代謝系統(tǒng)，達(dá)到生物體內(nèi)改變代謝流，擴(kuò)展代謝途徑和構(gòu)建新的代謝途徑的目的。第六十頁，共七十五頁。代謝工程具體思路1、改變代謝流1）加速速度限制反應(yīng)2）改變分支代謝途徑流向3）構(gòu)建代謝旁路4）改變能量代謝途徑2、擴(kuò)展代謝途徑和構(gòu)建新的途徑1）延伸代謝途徑2）構(gòu)建新的合成途徑第六十一頁，共七十五頁。ACBDEFGHJIK中心代謝途徑收斂途徑發(fā)散途徑指向中心代謝途徑，并以中心代謝途徑中間化合物為接口的途徑。代謝網(wǎng)絡(luò)組成的途徑類型以中心代謝途徑的中間化合物為起點(diǎn)，并由中心代謝途徑向周圍分散的途徑第六十二頁，共七十五頁。代謝分析中研究方法圖細(xì)胞在不同水平上對(duì)基因改變和環(huán)境變化的響應(yīng)，對(duì)于不同水平上各自的高通量研究方法為分析細(xì)胞的代謝提供了大量的信息第六十三頁，共七十五頁。S.Cerevisiae對(duì)不同氮源的吸收利用的途徑與機(jī)理

谷氨酸和谷氨酰胺在氮代謝中起著重要的作用，氨、谷氨酸和谷氨酰胺之間的相互轉(zhuǎn)化被稱為氮的中間代謝途徑(CNR)，如圖所示