腸桿菌科多重耐藥菌KPC酶的篩查

腸桿菌科多重耐藥菌KPC酶的篩查【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A我們通過對2010年1月至2014年1月期間在我院多個科室臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行KPC酶篩查，并對檢查結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，現(xiàn)將分析結(jié)果報告如下。資料與方法一般資料選取我院多個科室臨床分離的腸桿菌科細(xì)菌1600株為研究對象。經(jīng)過藥敏試驗后發(fā)現(xiàn)，這些菌株共有651株對頭孢菌素耐藥，在對這些耐藥菌株進(jìn)行初步篩選后發(fā)現(xiàn)，共有3株菌株對于碳青霉烯類抗生素耐藥。檢查方法藥敏試驗臨床標(biāo)本按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第3版）進(jìn)行接種分離。單個菌落使用Vitek2Compact進(jìn)行細(xì)菌鑒定、藥敏實驗及MIC值測定。按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)配合AES高級專家系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果判定和分析修正。質(zhì)控菌為大腸埃希菌ATCC25922。改良Hodge實驗按照2009年CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。在生理鹽水中準(zhǔn)備0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度的大腸埃希菌ATCC25922（指示菌），用生理鹽水稀釋10倍，按常規(guī)藥敏實驗操作規(guī)程接種到直徑為100mm的MH平板，晾干3-10min后在平板中央貼上厄他培南藥敏紙片(10ug)。接種碳青霉烯類抗生素耐藥或中介的菌株，以大腸埃希菌ATCC25922作陰性對照。接種時以無菌接種環(huán)取在血平板上過夜的待測菌落3-5個，從平板邊緣向中心劃20-25mm長的直線。35±2C需氧孵育16-20h后觀察結(jié)果，在劃線與抑菌圈交叉處細(xì)菌有增強生長的趨勢(典型為蘋果蒂樣生長)為陽性，否則為陰性。PCR擴增及測序依照相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計并合成碳青霉烯酶 KPC檢測引物，引物序列見表1[2]。擴增條件為：94C初變性15min,94C1min,68C2min,72C3min, 35個循環(huán)后72C延伸10min。擴增陽性產(chǎn)物送往測序公司進(jìn)行序列測定， DNA序列用NCBI網(wǎng)站(/)的Blast程序進(jìn)行比對確定基因型。統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS12.0軟件處理，計量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)量(X±S)表示，采用T檢驗。P?0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果藥敏試驗結(jié)果通過我們的研究發(fā)現(xiàn),在檢測的1600株細(xì)菌中,有651株對頭孢類抗生素耐藥,占所有菌株的40.6%。同時,在這651株耐藥菌株中,共發(fā)現(xiàn)3株對碳青霉烯類抗生素耐藥。改良Hodge實驗結(jié)果通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，對3株菌株進(jìn)行了劃線培養(yǎng)。經(jīng)過培養(yǎng)后觀察，3株菌株劃線與抑菌圈交叉處有增強生長的趨勢，出現(xiàn)蘋果蒂樣生長，這一結(jié)果說明3株菌株結(jié)果為陽性。PCR擴增及測序結(jié)果對3株待測菌進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，均得到KPC目的基因條帶。PCF陽日性產(chǎn)物經(jīng)測序，Blast程序比對證實均為blaKPC-2。討論近些年，碳青霉烯類抗生素對于腸桿菌科細(xì)菌的治療在臨床上是比較常見的。碳青霉烯類抗生素抗菌譜廣、抗菌活性強，尤其適用治療由產(chǎn)ESBLs或AmpC酶細(xì)菌所引起的嚴(yán)重感染，現(xiàn)已成為治療革蘭陰性多重耐藥細(xì)菌感染的一線用藥。然而，隨著此種藥物的使用廣泛度在不斷提高，已經(jīng)有大批相關(guān)工作者發(fā)現(xiàn)腸桿菌科細(xì)菌已經(jīng)對此藥物產(chǎn)生了耐藥性，尤以肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希菌為代表的腸桿菌科細(xì)菌最為明顯。近些年，已經(jīng)有文獻(xiàn)報道，產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶為腸桿菌科細(xì)菌耐碳青霉烯類抗生素的重要原因。 KPC酶是2001年美國從肺炎克雷伯菌中分離到的一種新型碳青霉烯酶，主要為質(zhì)粒介導(dǎo)，屬于Ambler分類的A類，Bush分類的2f組，能夠水解碳青霉烯類、青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南等多種抗生素，克拉維酸對KPC酶有抑制作用。到目前為止，國內(nèi)外已經(jīng)在腸桿菌科多個菌屬中檢測出KPC酶，包括：肺炎克雷伯菌、Cubana沙門菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、陰溝腸桿菌、阿氏腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、奇異變形桿菌、弗勞地枸櫞酸桿菌等。目前國內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn)10種KPC亞型，其中KPC-2檢出率最高。雖然通過常規(guī)診斷方法和一些實驗室輔助診斷技術(shù)可以對腸桿菌科細(xì)菌耐藥性進(jìn)行鑒別分析，但是關(guān)于該類細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥性，以及對KPC-2較為全面且準(zhǔn)確的篩查技術(shù)在臨床上還沒有很好的辦法。近幾年，已經(jīng)有很多相關(guān)學(xué)者把注意力放在改良Hodge實驗和PCR擴增技術(shù)對于KPC-2的鑒別篩查工作上，并取得了不錯的進(jìn)展。謝寧等人通過對該院分離的腸桿菌科細(xì)菌使用藥敏試驗進(jìn)行耐藥性檢測發(fā)現(xiàn)，其檢出率將近所有細(xì)菌的一半。同時，其還檢測出4株細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥性。為了進(jìn)一步分析該耐藥性的可靠性以及是否存在KPC-2，其通過改良后的Hodge實驗以及PCR擴增進(jìn)行篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有兩株細(xì)菌耐藥，且存在KPC-2。通過我們的研究可以發(fā)現(xiàn)，在檢測的1600株細(xì)菌中，有651株對頭孢類抗生素耐藥，占所有菌株的40.6%。同時，在這651株耐藥菌株中，共發(fā)現(xiàn)3株對碳青霉烯類抗生素耐藥。對3株菌株進(jìn)行改良后的